低氧誘導神經元特異性表達bFGF重組腺相關病毒載體構建研究

錢周敏

(溫州醫科大學仁濟學院，浙江 溫州 325035)

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低氧誘導神經元特異性表達bFGF重組腺相關病毒載體構建研究

錢周敏

(溫州醫科大學仁濟學院，浙江 溫州 325035)

目的：研究構建低氧誘導神經元特異性表達堿性纖維細胞生長因子(bFGF)重組腺相關病毒載體。方法：以堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)為治療靶基因，通過分子克隆手段，構建低氧誘導、神經元特異性表達bFGF的“時空”表達可調控性新型重組腺相關病毒(AAV)載體。結果：將重組質粒5HRE-3NRSE-bFGF的菌液送測序，得到測序結果，并與合成的DNA寡核苷酸序列進行比較，證實與設計序列完全一致。結論：構建、包裝重組腺相關病毒載體pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF有效。

青光眼；低氧誘導；神經元特異性；腺相關病毒(AAV)載體

青光眼是人類的第二大致盲疾病，機械壓迫和缺血缺氧所致的視網膜神經節細胞凋亡是該病致盲的主要原因。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)來源于中胚層和神經外胚層多種類型細胞，在腦和視網膜的發育及神經損傷修復過程中發揮重要作用。導師長期從事生長因子與創傷修復的基礎理論、臨床應用及其相關基因工程藥物方面研究，結果顯示bFGF具有神經保護與促進神經細胞軸突再生作用。bFGF為生物大分子，體外重組bFGF蛋白全身給藥難以透過血眼屏障發揮治療作用，若玻璃體腔內局部給藥，由于半衰期短則需反復注射，易導致眼內炎癥的發生，基因治療因可維持長時間的bFGF基因表達，是青光眼等慢性神經變性疾病治療的理想選擇。

1 材料與方法

1.1 技術路線

本研究采用AAV Helper-Free System(Stratagene)構建2型重組腺相關病毒載體，與傳統腺相關病毒載體構建方法比較，不存在輔助病毒的污染，并有效避免復制型腺相關病毒的產生，使用安全、高效。

①設計引物，分別以質粒pCMV6-XL4/bFGF為模板，PCR擴增目的基因bFGF；②通過基因重組手段，將bFGF插入質粒pCMV-MCS多克隆位點EcoRI/HindIII之間，重組質粒分別命名為pCMV-bFGF；③設計引物，以質粒pShuttle-5HRE-3NRSE-Luc為模板，PCR擴增基因表達調控序列5HRE-3NRSE；④設計引物，以pCMV-bFGF模板，PCR擴增目的基因序列Intron-bFGF-polyA；⑤設計引物，將5HRE-3NRSE與Intron-bFGF-polyA配對，通過重疊PCR手段擴增基因序列5HRE-3NRSE-Intron-bFGF-polyA；⑥所擴增的基因序列5HRE-3NRSE-Intron-bFGF-polyA經NotI酶切后，分別連接入質粒pAAV-MCS，所構建的重組質粒命名為pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF；⑦無內毒素質粒提取試劑盒中量制備所構建的重組腺相關病毒載體質粒pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF，及重組腺相關病毒包裝質粒pAAV-RC和輔助質粒pHelper。見圖1。

圖1 重組腺病毒載體質粒構建

1.2 材料

1.2.1 主要儀器 普通電冰箱(上海),高速冷凍離心機(Hitachi CR 2082，Japan),普通臺式高速離心機(上海),渦懸振蕩器(QL.866，海門市其林貝爾儀器制造有限公司),PCR擴增儀(9600型，PE公司，U.S.A),水平離心機(上海安亭科學儀器廠),穩壓穩流電泳儀(DYY.IIl2型，北京六一儀器廠),細菌培養箱(PYX.DHS.35×40，上海醫療器械七廠),超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)。

電子分析天秤(上海第二天平儀器制造廠),微量移液器(1000la l，20011 1，100μL，2-20la 1，0.5～10μL，Germany),普通槍頭(廣州威佳科技有限公司)。

1.2.2 菌株與質粒 菌株為大腸桿菌DH5 a，溫州醫學院中試基地提供。

質粒pENTR-D-TOPO-bFGF-IRES-hrGFP，由溫州醫學院中試基地提供,腺相關病毒所需的AAV Helper-Free System(Stratagene)由浙江省生物技術制藥工程重點實驗室提供。

1.2.3 主要試劑及試劑配制 75%乙醇(無水乙醇，國產分析純試劑),RT-PCR試劑盒(TaKaRaPrimeScriptTM RT-PCR Kit Cat：DRR014A),PCR引物(上海生工生物工程技術服務有限公司合成),1×TBE電泳緩沖液,10×Loading buffer(0．25%溴酚蘭，0．25%-"甲苯青FF，40%蔗糖水溶液),DNA Marker(TaKaRa寶生物工程有限公司),DNA片段凝膠回收試劑盒(TaKaRa，DV805A)。

LB培養基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g加入800mL滅菌水，充分溶解，加NaOH調節pH值至7.0，加滅菌水定容至1L，高壓滅菌后，40℃保存。

2 結果

酶切鑒定pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF：將菌種接種于LB液體培養基內，搖菌過夜，次日提取質粒，并純化。電泳結果，與預期結果一樣。見圖2。

圖2 pAAV-5HRE-3NRSE-bFGF酶切鑒定——10000maker

3 討論

基因治療防治青光眼具有廣泛的應用前景,但臨床應用尚需進一步研究。理想基因治療將遺傳物質100%轉移，并定點整合到細胞基因組中，在細胞中長期、特異地表達并按特定要求受到控制,但目前基因轉移難以滿足要求。眼科應用還要解決眼部的特異性及避免全身副作用等問題。探索理想基因轉移方法,解決基因轉移效率,提高基因表達水平及持續性,可成功轉移基因治療疾病。隨著基因治療基礎研究的發展, 基因治療必將應用于眼科疾病,并為青光眼的治療提供全新手段。

[1] GUPTA N, YüCEL YH. Glaucoma as a neurodegenerative disease[J].Curr Opin Ophthalmol,2007,18(2):110-114.

[2] NICKELLS RW. Ganglion cell death in glaucoma: from mice to men[J].Vet Ophthalmol,2007 ,10(Suppl 1):88-94.

[3] LEVIN LA. Neuroprotection and regeneration in glaucoma[J].Ophthalmol Clin North Am,2005, 18(4):585-596, VII.

[4] 李校堃，胡愛蓮，鄭遠遠.基因重組堿性成纖維細胞生長因子對大鼠視網膜神經節細胞的影響[J].中國病理生理雜志，2002，18(2):147-149.

[5] 洪岸，李校堃，宿寶貴，等.基因重組堿性成纖維細胞生長因子對大鼠脊髓損傷神經保護作用[J].暨南大學學報：自然科學版，2001，22(1):99-103.

(責任編輯：李嵐春)

2014-11-24

浙江省大學生科技創新活動計劃創新項目(新苗人才計劃)“低氧誘導神經元特異性表達bFGF重組腺相關病毒載體的構建”(2012R413023)

錢周敏(1991-)，男，溫州醫科大學仁濟學院在讀生，研究方向為中藥學。

R741

A

1673-2197(2015)06-0005-02

10.11954/ytctyy.201506002