正交設計多指標綜合評分優化鱉甲微波滅菌工藝

萬 露，閔紅燕，肖云芝，張文騫，申寶德，韓 晉*，袁海龍*

(1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330000；2.中國人民解放軍第三〇二醫院，北京 100039；3.成都中醫藥大學，四川 成都 611137)

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正交設計多指標綜合評分優化鱉甲微波滅菌工藝

萬 露1,2，閔紅燕1，肖云芝3，張文騫2，申寶德2，韓 晉2*，袁海龍2*

(1.江西中醫藥大學，江西 南昌 330000；2.中國人民解放軍第三〇二醫院，北京 100039；3.成都中醫藥大學，四川 成都 611137)

目的：優選鱉甲的微波滅菌工藝。方法：以藥材含濕率、滅菌時間、滅菌功率為考察因素，以滅菌率和鱉甲抗肝纖維化作用(人肝星狀細胞LX-2生長抑制率)為評價指標，采用正交設計多指標綜合評分法優化微波滅菌鱉甲的工藝參數。結果：最佳微波滅菌工藝參數：滅菌時間為6min，藥材含濕率為20%，滅菌功率為4 000W。結論：正交設計多指標綜合評分法可用于鱉甲微波滅菌工藝的參數優化，該方法簡便可行，且滅菌效率高，對鱉甲抗肝纖維作用無影響。

鱉甲；微波滅菌；正交設計；多指標綜合評分

復方鱉甲軟肝片是我國治療慢性肝炎纖維化、早期肝硬化的首選藥[1]，主要由鱉甲、赤芍、當歸等11味藥組成，其中鱉甲為原材料粉碎直接入藥。國家食品藥品監督管理總局(CFDA)明確規定：中藥原粉入藥品種必須選擇合適的方式進行滅菌[2]，藥材的滅菌工藝是影響制劑質量的重要因素。

不當的滅菌方法會破壞中藥材中的有效成分而降低其療效，也可使藥材產生一些有害物質或殘留滅菌介質從而損害機體，也可導致活性成分遷移。因此以原粉入藥的中藥的滅菌方法與一般藥材不同，應有嚴格的工藝要求。常用中藥滅菌方法包括濕熱滅菌、紫外線滅菌、環氧乙烷滅菌法、濾過除菌、臭氧滅菌、干熱滅菌法、Co60輻射滅菌等，但均存在一定不足[3]。據文獻報道，微波滅菌技術具有良好的滅菌效果，其穿透力強、時間短、效率高，對藥材的成分不造成影響[4-5]。CFDA在進行中藥新藥審評時[6]，對微波滅菌技術的效果給予了肯定，認為其是理想的中藥材滅菌方法。

本研究采用微波滅菌法處理復方鱉甲軟肝片中以原粉入藥的鱉甲，為避免單一指標進行工藝優化時產生偏差且兼顧微波滅菌的效果與藥材質量，擬以滅菌率和肝星狀細胞LX-2的生長抑制率為考察指標，采用正交設計多指標綜合評分法優化微波滅菌工藝，篩選最佳滅菌工藝，現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YHD-4HMY型微波殺菌機(北京億慧達微波設備有限公司，工作頻率為2 450MHz，微波功率最大可調6 000W)；BAS-124S電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；XDS-1B倒置生物顯微鏡(北京京瑞天下科技有限公司)；Forma Series II水套CO2培養箱(Thermo Fisher)；Multiskan GO全波長酶標儀(Thermo Scientific)。

1.2 試藥

鱉甲藥材(中國人民解放軍第三〇二醫院提供，經中國人民解放軍第三〇二醫院袁海龍研究員鑒定為鱉甲)；pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(北京三藥科技開發公司，批號：140306)；細菌營養瓊脂培養基(北京三藥科技開發公司，批號：140212)；霉菌玫瑰紅鈉瓊脂培養基(北京三藥科技開發公司，批號：140228)；水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

胎牛血清(美國HyClone公司，批號：DPEO167)；二苯基四氮唑藍(MTT，批號：1325B38)、二甲基亞砜(DMSO，批號：20130505324)均購自美國Amresco公司；LX-2肝星狀細胞(北京協和細胞資源中心)。

2 方法與結果

2.1 因素水平確定

在微波干燥滅菌的實踐經驗和前期單因素試驗基礎上，選取滅菌功率(A)、滅菌時間(B)和藥材含濕度(C)為考察因素，每個因素設定3個水平，具體因素水平見表1。

表1 鱉甲微波滅菌工藝正交實驗因素水平

2.2 藥材處理

稱取粉碎的鱉甲3份，每份0.20kg，分別以10%、20%、30%純化水拌潤均勻，取樣，檢測細菌數。按照L9(34)正交表安排試驗，微波真空干燥箱溫度設定為60℃，潤濕鱉甲藥材后以一定的厚度(1～3cm)均勻平鋪于微波真空干燥箱內部托盤上，按照預定的滅菌功率和時間對鱉甲進行滅菌處理，滅菌結束后，立即將藥材裝入已滅菌的容器中備用。

2.3 微生物限度檢查[8]

參照《中國藥典》2010 年版一部附錄ⅩⅢ中的微生物限度檢查法，取滅菌前后藥材各10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液溶解至100mL，作為1∶10供試液。取1∶10供試液1mL加0.9%無菌氯化鈉溶液至10mL，作為1∶100供試液。采用稀釋法(0.5mL/皿)檢查(附錄ⅩⅢ C)細菌數，采用常規法檢查酵母菌數，采用常規法檢查控制菌數。

滅菌率(%)=(滅菌前細菌數-滅菌后細菌數)/滅菌前細菌數×100%。

2.4 MTT法測定鱉甲抗纖維化作用

2.4.1 細胞系及其培養條件 LX-2肝星狀細胞系在含有20%胎牛血清、1.0×103U/L青霉素、100mg/L鏈霉素以及必需氨基酸和葡萄糖等營養物質的培養液中，于37℃、5%CO2環境下進行常規培養，實驗均在細胞生長對數期時進行。

2.4.2 供試品溶液配制 精密稱取滅菌前及不同滅菌條件下處理的鱉甲各5g，分別置于50mL具塞錐形瓶中，加75%乙醇25mL，稱重，超聲提取60min，取出放冷后再稱重，補足減少的重量，搖勻，離心10min(7 000r/min)。提取液過0.45μm微孔濾膜，取續濾液，冷凍干燥，供抗肝纖維化試驗使用。

2.4.3 鱉甲藥材提取液細胞抑制率測定 前期實驗[8]確定了樣品最佳添加量為35%濃度。取對數生長期LX-2肝星狀細胞，采用胰酶常規消化成單細胞懸液，接種至96孔板中(每孔約5×104細胞)，孔板四周以無菌PBS填充以防止邊緣效應。細胞置于96孔板中貼壁24h后(每孔200μL)[9]，將其分成10組分別給予35%濃度滅菌前鱉甲藥粉溶液、滅菌后鱉甲藥粉溶液(含0.1%DMSO的培養基溶液)，并設置8個空白對照孔(加入含相應濃度生理鹽水的DMEM培養基)和8個調零孔，細胞在37℃、5%CO2條件下培養48h后，加入5mg/mL MTT溶液20μL，繼續培養4h后，小心吸取培養液，每孔加入DMSO溶液200μL，搖床低速振蕩10min后，采用酶聯免疫檢測儀測定各孔在490nm處的吸光度值，實驗重復3次。結果見表2，方差分析見表3。

抑制率=(A0-A1) / A0，其中A0為陰性對照組吸光度值，A1為藥物組吸光度值。

2.5 正交試驗結果

按照L9(34)正交設計表進行試驗，分別測定各條件下的滅菌率和細胞抑制率。

采用綜合加權評分法[10-11]，結合該工藝的特點和相關文獻，權衡各指標對處方的影響，設定指標滅菌率(X/%)和 細胞抑制率(Y/%)的權重系數分別為0.6、0.4 ，根據各指標的權重，計算多屬性綜合評價指標，對正交試驗數據進行綜合分析，綜合評分=0.6X/98.1+0.4Y/50.97，結果見表2、表3。

直觀分析表明，以綜合評分為標準，在所選因素水平范圍內，各因素作用主次順序為B>C>A，方差分析表明，B(滅菌時間)為主要影響因素，具有顯著性(P<0.05)，最終確定最佳提取工藝為A2B2C2，即滅菌功率為4 000W，滅菌時間為6min，藥材含濕率為20%。

2.6 最佳工藝條件驗證

按照最佳工藝條件滅菌3批鱉甲藥材，測得鱉甲中各指標成分含量，并計算綜合評分，結果見表4，與預測值接近，其RSD為0.863%。鱉甲中霉菌及酵母菌數每1g<100cfu，微生物控制菌，包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均未檢出，證明該方法穩定可行。

表2 微波滅菌工藝L9(34)正交試驗設計及結果

表3 鱉甲微波滅菌工藝正交試驗方差分析

表4 鱉甲最佳微波滅菌工藝驗證結果 (%)

3 討論

據文獻報道，微波的穿透深度為 3～5cm[14]，本研究亦表明，當藥材平鋪厚度為1～3cm時，粉碎粒徑大小對其滅菌效果影響不大，說明微波可穿透至介質和藥材的深部，可使藥材表里一致的均勻受熱，且滅菌時間越長，滅菌率越高。由于鱉甲中的活性成分為蛋白質及多肽類，其分子結構特殊，溫度的升高可導致多肽主鏈氨基酸降解以及側鏈氨基酸殘基變化[15]，大大影響藥材質量。因此，本實驗選擇對微波滅菌效果影響最大的三個因素進行考察，篩選出符合實際工藝的兩個評價指標，以滅菌率評價滅菌效果，以人肝星狀細胞LX-2生長抑制率評價鱉甲抗肝纖維化作用。本研究采用多指標綜合加權評分法對實驗結果進行分析，較單一指標更為科學，且對各指標數據進行必要的標準化處理，保證了評價指標的全面性，使滅菌工藝的優化更為合理。

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(責任編輯：尹晨茹)

Optimization of the Microwave Sterilization Technology of Carapax Trionycis by Orthogonal Design with Multi-index Comprehensive Evaluation Method

Wan Lu1,2,Min Hongyan1,Xiao Yunzhi3,Zhang Wenqian2,Sheng Baode2,Han Jin2*,Yuan Hailong2*

(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Jiangxi 330000,China;2.302 Military Hospital of China,Beijing 100039,China；3.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective:To optimize the microwave sterilization technology of Carapax Trionycis.Methods:Orthogonal design was carried out to achieve the best microwave sterilization technology of C.Trionycis by the multi-index comprehensive evaluation method with herbs moisture content,sterilization time and microwave power as investigation factors,and sterilization rate and anti-hepatic fibrosis efficacy (the LX-2 hepatic stellate cell proliferation inhibition rate) as indexes.Results:The best sterilization technology was as follows: herbs moisture content 20%,sterilization time 6 min and microwave power 4 000W.Conclusion:It is simple and feasible that using orthogonal design with multi-index comprehensive evaluation method to optimize the microwave sterilization technology of C.Trionycis.This method not only has high sterilization efficiency,but also has no effect on C.Trionycis anti-hepatic fibrosis efficacy.

Carapax Trionycis;Microwave Sterilization;Orthogonal Design;Multi-index Comprehensive Evaluation

2014-10-11

國家新藥創制重大專項(2011ZX09201-201-14)；軍隊醫療機構制劑標準提高科研專項(13ZJZ12，13ZJZ12-5)

萬露(1989- )，女，江西中醫藥大學碩士研究生，研究方向為中藥新制劑、新劑型、新技術。

袁海龍，男，博士，中國人民解放軍第三〇二醫院研究員，博士生導師，研究方向為中藥新型給藥系統。E-mail: yhlpharm@126.com；韓晉，女，中國人民解放軍第三〇二醫院主任藥師，博士生導師，研究方向為中藥劑型與工程技術。E-mail: hanjin302emba@163.com

R284;R954

A

1673-2197(2015)06-0026-03

10.11954/ytctyy.201506011