不同粉體三、四妙丸HPLC指紋圖譜對比研究

肖 娟，蔡 萍，萬 丹，張水寒

(湖南省中醫藥研究院 湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建重點實驗室，湖南 長沙 410006)

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不同粉體三、四妙丸HPLC指紋圖譜對比研究

肖 娟，蔡 萍，萬 丹，張水寒*

(湖南省中醫藥研究院 湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建重點實驗室，湖南 長沙 410006)

目的：分別建立超微粉和細粉三妙丸和四妙丸的HPLC指紋圖譜，并進行對比研究。方法：用HPLC色譜法，對不同粉體形態的妙丸建立指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件”建立標準指紋圖譜，對不同粉體形態各妙丸的指紋圖譜進行相似度分析。結果：方法的重復性及穩定性良好。兩種不同粉體形態的妙丸指紋圖譜的相似度均大于0.90，兩者在共有峰上沒明顯差別，而峰面積有差別。結論：該方法穩定準確，建立的HPLC指紋圖譜，能從整體上反映出三妙丸和四妙丸的化學成分信息，為建立質量標準提供了參考依據。

妙丸；HPLC 指紋圖譜；超微粉

二妙丸、三妙丸和四妙丸均是收載于2010版《中國藥典》的經典名方，廣泛用于治療濕熱痰痹引起的各種濕熱浸淫疾患[1-3]。三妙丸、四妙丸都是從二妙丸演變而來，三妙丸中多了一味化瘀通絡、補肝強腎、引藥下行的牛膝；四妙丸中薏苡仁能利濕舒筋，故主治下焦濕熱之痹證、痿證[4-5]。與傳統粉碎技術相比，超微粉碎技術可將中藥材粉碎成微米級甚至納米級，顯著提高了藥材細胞壁的破碎率，粒徑大小分布更均勻，表面積增加，利于有效成分的溶出、釋放與吸收，提高生物利用度[6]。有文獻報道[7]超微粉妙丸功效明顯優于細粉丸。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒別手段, 通過指紋特征相似程度的比較, 可達到判斷藥材及成藥的真偽、優劣、質量的穩定性和一致性,也已經成功用于中成藥生產過程中[8]。本研究通過建立細粉和超微粉三妙丸和四妙丸HPLC指紋圖譜，以探索HPLC指紋圖譜能否全面反映出化學成分信息以及不同粉體間存在的差異，為制定質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BFM-T6BI“貝利”微粉機(濟南貝利粉碎技術工程有限公司)；Winner3001 干粉激光粒徑儀(濟南微納儀器有限公司)；柴田式粉碎機(天津市渤海鑫茂制藥設備有限公司)；可傾式多功能制丸機(DZ-20,溫嶺市林大機械有限公司)； 高效液相色譜儀 (SHIMADZ-LC-20A，日本島津)；色譜柱：Inertsil ODS-2(GL Sciences Inc，250mm×4.6mm,5μm)；T-214電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

1.2 試劑

甲醇(色譜級)，甲醇(分析純)，醋酸(色譜級), 怡寶蒸餾水。

鹽酸小檗堿對照品(批號：110713-200208，中國食品藥品檢定研究院)。

1.3 材料

細粉和超微粉三妙丸和四妙丸均為實驗室自制，經檢驗符合藥典要求。

細粉妙丸制劑工藝：取處方比例的藥材，混合采用柴田式粉碎機粉碎，過5號篩，得細粉，混勻，在可傾式多功能制丸機中用水泛丸，70℃干燥，滅菌即得。

超微粉妙丸最佳制劑工藝：取處方比例的藥材混合，采用貝利粉碎機粉碎，粉碎最佳參數是藥材干燥至水分7%以下，介質填充率60%～70%，振幅為5mm，粉碎溫度1～15℃，粉碎時間25min,采用Winner3001 干粉激光粒徑儀測得粉體粒徑的D90<90μm(90%粒徑值)，得超微粉混勻，在可傾式多功能制丸機中用水泛丸，70℃干燥，滅菌即得。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為: Inertsil ODS-2(GL Sciences Inc，250mm×4.6mm,5μm)

三秒丸：流動相為: A為1%的醋酸水溶液，B為1%的醋酸甲醇溶液；梯度洗脫：0～10min： 2%～5% B，10～15min 5%～15% B，15～25min 15%～25% B，25～45min 25%～55% B，45～65min 55%～85% B。

檢測波長:254nm，柱溫: 35℃，流速:1.0mL·min-1，進樣量:10μL。

四妙丸：流動相為: A為水溶液，B為甲醇；梯度洗脫：0～45min 10%～45% B，45～65min 45%～85% B。

檢測波長:280nm，柱溫: 30℃，流速:1.0mL·min-1，進樣量: 10μL。

2.2 對照品溶液制備

取鹽酸小檗堿適量，精密稱定，置于10mL的量瓶中，加甲醇制成濃度為0.1mg·mL-1的對照品溶液，用0.45μm的微孔濾膜濾過，備用。

2.3 供試品制備

取10批細粉三妙丸適量，研細，取粉末6.0g，精密稱定，至于索氏提取器中，精密加入乙醚100mL，35℃水浴回流5h，棄去乙醚液，殘渣揮去乙醚加95%乙醇60mL,回流提取1h，過濾；殘渣加50%乙醇60mL，回流提取2次過濾，合并提取液，濃縮至20mL，用60%乙醇定容至25mL，搖勻，作為供試液，進樣前用0.45μm微孔濾膜濾過，得細粉三妙丸供試品。

取10批超微粉三妙丸適量，研細，取粉末6.0g，精密稱定，得超微粉三妙丸供試品。

取10批細粉四妙丸適量，研細，取粉末6.0g，精密稱定，得細粉四妙丸供試品。

取10批超微粉四妙丸適量，研細，取粉末6.0g，精密稱定，得超微粉四妙丸供試品。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件連續進樣5次,記錄指紋圖譜，以參照峰為對照峰計算主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積，結果RSD<2.0%,相似度均大于0.95，符合指紋圖譜要求，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液10μL, 按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8h測定,記錄指紋圖譜，以參照峰為對照峰計算主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積，結果RSD<2.0%,相似度均大于0.93，符合指紋圖譜要求，表明8h內樣品穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取超微粉三妙丸同一批次樣品5份,按“2.3.1”項下供試品溶液制備條件操作制備供試品溶液,進樣分析，記錄指紋圖譜，以參照峰為對照峰計算主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積，結果RSD<2.0%,相似度均大于0.94，符合指紋圖譜要求，表明方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及分析

2.5.1 參照峰的選擇 由于黃柏中鹽酸小檗堿的含量高，且保留時間恰當，也是質量控制的指標成分，故選用鹽酸小檗堿作為參照峰。按“2.1”項下三妙丸的色譜條件進樣，記錄色譜，見圖1。

圖1 鹽酸小檗堿對照品液相色譜

2.5.2 指紋圖譜數據的采集 分別取不同粉體三妙丸和四妙丸的供試品，按照“2.1”項下的妙丸的色譜條件方法分別得到細粉和超微粉妙丸的指紋圖譜，均以鹽酸小檗堿為參照峰，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2004 A版)分別對妙丸的共有色譜峰相對保留時間和相對峰面積進行統計。

2.5.3 共有峰的標定 對10批樣品的圖譜分析比較，計算各妙丸中不同批次供試品色譜圖中共有峰占總面積的百分比，結果表明共有峰面積占總面積90%以上，符合指紋圖譜的要求。

2.5.4 指紋圖譜共有模式的建立及相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2004 A版)分別對三妙丸和四妙丸進行相似度分析，以三妙丸為例，以鹽酸小檗堿峰為參比峰,以S4為參照圖譜，經過多點校正、自動匹配，采用中位數法生成對照圖譜(圖2)，標示了細分和超微粉三妙丸指紋圖譜中15個共有峰,其中11號峰為鹽酸小檗堿峰；同理得到四妙丸中共有峰15個，見圖3、圖4、圖5、圖6。

圖2 三妙丸典型的HPLC指紋圖譜

2.5.5 相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2004 A版)進行相似度分析，不同粉體三妙丸和四妙丸之間HPLC指紋圖譜的相似度均大于0.91，細粉和超微粉四妙丸之間的相似度大于0.90，符合指紋圖譜要求。

本實驗建立的指紋圖譜可以從整體上反映出三妙丸和四妙丸化學成分信息，為質量標準提供參考；從指紋圖譜的共有峰來看，不同粉體沒有顯著差別，但在共有峰面積上，超微粉妙丸的峰面積要大于細粉妙丸(見表3、表4，S1/S2>1)，說明藥材經超微粉碎后，粉末均勻，粒徑減小但表面積增大，與提取溶媒的接觸面積增加，相同的提取時間內提取效率提高，有效成分溶出量增加，生物利用度提高，在保證藥效的基礎上，可在一定程度上減少給藥劑量，提高效率。

3 討論

各妙丸檢測波長的選擇都是通過HPLC-DAD檢測, 在色譜條件下,繪出三維色譜圖, 選擇色譜峰信息完整,分離度好, 基線平穩,干擾最少的波長。采用單因素法對各妙丸的提取方法進行考察，回流提取效率更高，且乙醚除去蒼術中的揮發油使得色譜峰的分離度更好，檢測信號更平穩，確定采用“2.3”項的提取方法。

圖3 10批超微粉三妙丸的HPLC指紋圖譜

圖4 10批細粉三妙丸的HPLC指紋圖譜

圖5 10批超微粉四妙丸的HPLC指紋圖譜

圖6 10批細粉四妙丸的HPLC指紋圖譜

峰號S1S2S1/S2峰號S1S2S1/S219811659344731．059173886816609091．0524503594597791．02106962646625751．0538243667595531．091190416247869255941．0444704754373081．08125631165316601．0659743668982991．081311872848113481301．0565098434867241．051414359716182271．057240000122895371．051512274819354021．0488426197813031．08

表4 不同批次細粉、超微四妙丸共有峰峰面積均值及相應比值

注：S1是10批超微粉妙丸各共有峰峰面積均值;S2為10批細粉妙丸各共有峰峰面積均值。

由于薏苡仁和牛膝的紫外吸收特征較弱，在方劑配伍中用量較少，建立的指紋圖譜中兩者的特征峰不明顯。此外，還需要對指紋圖譜中色譜峰進行對應藥材的歸屬。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010:454-646.

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[3] 李祥，趙亮，呂磊，等. 三妙丸及其組方藥材的化學成分、質量控制及臨床應用[J].藥學服務與研究，2013,13(4):274-277.

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(責任編輯：余 婷)

HPLC Fingerprint Study on Ultro-micro and Nomlal powder of San and Si Miao Pill

Xiao Juan, Cai Ping, Wan Dan, Zhang Shuihan*

(Hunan Acadamy of Chinese Medicine Hunan Chinese Medicine Powder and Innovation Drug Province Department Coconstruction and Key Laboratories, Ministry of Education,Changsha 410006,China)

Objective:To establish HPLC fingerprint of Ultro-micro and Nomlal powder of San and Si Miao Pill respectively and compare the fingerprints.Methods:To establish HPLC fingerprint of Ultro-micro and Nomlal powder of Miao Wan. The HPLC chromatograms were analyzed by the the “traditional Chinese medicine fingerprint similarity calculation software”.Results:The results of methodological study met technical requirements of HPLC fingerprint. The similarities of the Ultro-micro and Nomlal Miao Wan exceeded 0.90, The HPLC fingerprints of Ultro-micro and Nomlal Miao Wan had obvious differences in area of common peaks but less differences in number of common peaks.Conclusion:The HPLC fingerprint method was stable and accurate and could show the whole chemical composition information and provide a basis for the establishment of quality standard for Miao pill.

San and Si Miao Pill；HPLC fingerprint；Ultro-micro Powder

2015-07-10

湖南省戰略性新興產業科技攻關與重大科技成果轉化項目(2012GK4103)

肖娟(1978-)，女，湖南省中醫藥研究院實驗師，研究方向為中藥制劑。

張水寒(1960-)，女，博士，湖南省中醫藥研究院博士生導師，研究方向為中藥資源、制劑及質量標準。E-mail：zhangshuihan0220@126.com

R284.1

A

1673-2197(2015)23-0027-04

10.11954/ytctyy.201523011