武漢地區(qū)黃瓜靶斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究

楊紹麗等

摘 要：2011年7月在武漢黃陂發(fā)現(xiàn)黃瓜靶斑病，對(duì)病樣進(jìn)行分離、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)鑒定，并對(duì)病原進(jìn)行了生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明，引起武漢地區(qū)黃瓜靶斑病的病原菌為多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。這是多主棒孢霉在武漢引起黃瓜靶斑病的首次報(bào)道。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，光照有利于病原菌菌絲生長(zhǎng)；病原菌菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度范圍為25～30℃；最適宜pH值為6～9；病原菌能夠利用多種碳源和氮源，碳源以麥芽糖利用效果最好，氮源以硝酸鉀利用效果最好。

關(guān)鍵詞：黃瓜；靶斑??；多主棒孢霉；生物學(xué)特性

黃瓜靶斑?。–orynespora cassiicola），又名黃瓜褐斑病，在我國(guó)遼寧[1，2]、河南、河北、山東、寧夏、甘肅、江蘇、上海、廣東等地黃瓜上發(fā)生嚴(yán)重[3～10]。2011年7月首次在武漢栽培黃瓜上發(fā)現(xiàn)有類似靶斑病的癥狀，2011-2014年武漢各露地蔬菜和設(shè)施蔬菜均發(fā)現(xiàn)有靶斑病為害。本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)病原菌的形態(tài)特征、致病性以及生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，以明確武漢地區(qū)導(dǎo)致該病害發(fā)生的病原菌種類及該病原菌對(duì)不同理化環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件的需求，以期對(duì)其發(fā)生規(guī)律和防治措施進(jìn)行有效探索。

1 材料與方法

1.1 病樣采集及癥狀觀察

2011-2014年在武漢黃陂、蔡甸等蔬菜基地黃瓜上發(fā)現(xiàn)有疑似靶斑病癥狀，觀察記錄癥狀并拍照。

1.2 病樣的分離

采用常規(guī)組織分離法[11]：取病斑典型的新鮮葉片，用無(wú)菌水沖洗干凈，切取病健交界處的組織，先用0.1%升汞消毒1～2 min，再用75%酒精消毒1 min左右，最后用無(wú)菌水沖洗3次，每次1 min。消毒完成后，吸干組織表面水分，再將可能被殺死的組織剪去，剪成小塊，每皿3～5塊，接在PDA平板上，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。菌落形成后，選典型菌落轉(zhuǎn)接3次，進(jìn)行純化，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測(cè)定

采用孢子懸浮液噴霧接種法：將菌株在PDA上暗培養(yǎng)，待產(chǎn)孢后在培養(yǎng)皿中加無(wú)菌水，再用干凈玻片刮取孢子，4層紗布過(guò)濾制成孢子懸浮液，濃度為103～104個(gè)/mL。取生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)出2片真葉的健康黃瓜苗，用上述孢子懸浮液噴霧接種到黃瓜葉片，接種后保濕24 h，觀察記錄發(fā)病情況，發(fā)病后再?gòu)陌l(fā)病部位取樣進(jìn)行再分離，以確定是否為致病菌。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證，確定引起黃瓜靶斑病的病原。將供試菌株接種到PDA平板上，25℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，描述菌落顏色、形態(tài)，挑取培養(yǎng)物，用顯微鏡觀察分生孢子器、分生孢子形態(tài)，測(cè)量其大小。

1.5 病原菌生物學(xué)特性

①光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 在活化培養(yǎng)7 d的菌落邊緣，打取直徑6 mm的菌餅，接種于PDA平板中央。將接菌后培養(yǎng)皿置于25℃ HP250GS智能型人工氣候培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。設(shè)置連續(xù)黑暗、12 h光暗交替、連續(xù)光照3個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

②不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 在活化培養(yǎng)7 d的菌落邊緣，打取直徑6 mm的菌餅，接種于PDA平板中央，將接菌后的培養(yǎng)皿分別置于5、10、15、20、25、30、35、40℃恒溫箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

③不同 pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將PDA 培養(yǎng)基的 pH值分別調(diào)節(jié)為3.0，4.0，5.0，6.0， 7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，制成不同pH值的平板，在平板中央接種6 mm 的新鮮菌餅，3個(gè)重復(fù)，25℃恒溫暗培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

④不同碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 以查氏培養(yǎng)基[11]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。用含碳量相同的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、果糖、可溶性淀粉代替其中的蔗糖。用含氮量相同的尿素、硝酸鈉、硝酸銨、氯化銨、精氨酸代替其中的硝酸鉀。在活化培養(yǎng)7 d的菌落邊緣，打取直徑為6 mm的菌餅，接種在不同碳、氮源平板中央，3個(gè)重復(fù)，置于25℃恒溫箱培養(yǎng)，5 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜靶斑病田間癥狀及病原菌的分離培養(yǎng)

2011年7月在武漢黃陂武湖黃瓜展示田，發(fā)現(xiàn)黃瓜中下部葉片出現(xiàn)疑似靶斑病的癥狀。葉片發(fā)病初期為黃色水浸狀斑點(diǎn)、稍凹陷。發(fā)病中期病斑擴(kuò)大為近圓形、圓形或不規(guī)則形，灰白色，在圓形或近圓形病斑中央常會(huì)有淡黃色的小斑點(diǎn)（圖1A）。中后期多個(gè)病斑常連成片。該病常與霜霉病、細(xì)菌性角斑病混合發(fā)生，易與細(xì)菌性角斑病混淆。

2011-2014年每年從發(fā)病嚴(yán)重的田塊，采集疑似靶斑病病樣標(biāo)本，對(duì)8份樣品進(jìn)行分離，均能分離出棒孢霉屬（Corynespora sp.）真菌且形態(tài)一致。以2011年分離菌株HPbb為典型菌株進(jìn)行鑒定，本文中涉及到病原菌的所有試驗(yàn)，使用的均為該菌株。

2.2 致病性測(cè)定

配制103～104個(gè)/mL的分生孢子懸浮液噴霧接種于20株2片真葉期黃瓜幼苗，結(jié)果表明，植株的發(fā)病率為100%。接種3 d后，零星有葉片出現(xiàn)水浸狀病斑，7 d后出現(xiàn)典型病斑，同田間發(fā)病癥狀（圖1A）一致，對(duì)照無(wú)癥狀（圖1B）。從發(fā)病葉片再次分離，獲得培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征與接種菌一致的分離物。

2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

分離物在PDA培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，菌落平、致密，呈輻射狀展開(kāi)，邊緣規(guī)則，氣生菌絲絨毛狀，顏色為灰色、褐色至灰黑色，5 d后菌落平均直徑46.7 mm（圖2A）。菌絲淡褐色，有隔膜，分枝。分生孢子梗淡褐色、直或彎曲、不分枝、具隔膜，分生孢子梗有層出現(xiàn)象，大小多為（90～210）μm×（3～5）μm。分生孢子淺褐色，壁平滑，倒棍棒形，頂端鈍圓，直或彎曲，具有假隔膜2～9個(gè)，大?。?0～195.5）μm×（5～10）μm（圖2B），孢子幼時(shí)單生或串生（圖2C）。

通過(guò)對(duì)PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)形態(tài)、菌絲、分生孢子、分生孢子梗等形態(tài)的描述，這些特征與其他文獻(xiàn)[5，9，10，12～15]報(bào)道的關(guān)于黃瓜靶斑病多主棒孢菌的描述基本一致，確定引起武漢地區(qū)黃瓜靶斑病的病原為多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。

2.4 病原菌生物學(xué)特性研究

①光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖3可以看出，在連續(xù)黑暗、12 h光暗交替、連續(xù)光照3種條件下，病原菌在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，連續(xù)光照條件下菌落平均直徑最大，達(dá)50.67 mm，說(shuō)明光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

②溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖4結(jié)果可以看出，不同溫度下生長(zhǎng)5 d，病原菌菌落直徑差異顯著，說(shuō)明溫度對(duì)病菌的生長(zhǎng)影響很大。病原菌在10～35℃均能生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)最適溫度為25～30℃；30℃時(shí)，5 d菌落直徑最大，達(dá)51.0 mm；5℃以下及溫度達(dá)到40℃時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)。

③pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖5可以看出，PDA平板上，病原菌菌絲在pH值3～12時(shí)均可生長(zhǎng)，適宜生長(zhǎng)的pH值為6～9；其中pH值為8時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，5 d后菌落平均直徑51.83 mm。說(shuō)明該菌最適合在中性偏堿條件下生長(zhǎng)。

④碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 由表1可以看出，病原菌能夠利用多種碳源和氮源，其中以麥芽糖作碳源最有利于菌絲生長(zhǎng)，5 d后菌落直徑達(dá)到47.17 mm，其次是乳糖，可溶性淀粉最差；以硝酸鉀作氮源最利于菌絲生長(zhǎng)，5 d后菌落直徑達(dá)到39.83 mm，氯化銨利用效果最差。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)病原菌的分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)鑒定以及致病性測(cè)定，引起武漢地區(qū)黃瓜靶斑病的病原為Corynespora cassiicola，為半知菌亞門(mén)多主棒孢霉，該病原形態(tài)與前人研究[3～5，9，14，15]描述的黃瓜靶斑病（褐斑?。┎≡螒B(tài)基本一致。對(duì)病原菌生物學(xué)特性研究表明，黃瓜靶斑病菌在10～35℃下均能生長(zhǎng)，最適溫度為30℃，與前人研究[2，5，15，16]報(bào)道的基本一致；光照能促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，與劉鳴韜等[16]的報(bào)道一致；本研究中最適宜病原菌菌絲生長(zhǎng)的pH值為6～9，與鄒慶道等[15]的研究結(jié)果基本一致，而李長(zhǎng)松等[5]的研究結(jié)果中菌絲生長(zhǎng)最適宜pH值為5～8，說(shuō)明黃瓜靶斑病菌菌絲生長(zhǎng)在不同地區(qū)對(duì)pH值的要求不同。本研究中病原菌能夠利用多種碳、氮源，碳源以麥芽糖和乳糖效果最好，與劉鳴韜等[16]研究結(jié)果基本一致；在氮源利用上，以硝酸鉀作氮源最有利于菌絲生長(zhǎng)。以上研究結(jié)果表明，引起武漢地區(qū)黃瓜靶斑病的病原多主棒孢霉是一種耐高溫、最適宜中性弱堿環(huán)境生長(zhǎng)并能夠利用多種碳氮源的病原真菌。本研究結(jié)果為今后了解多主棒孢霉的侵染和靶斑病病害流行奠定了基礎(chǔ)，對(duì)其他因子以及分生孢子的生物學(xué)特性有待進(jìn)一步研究。

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