阿托伐他汀對兔急性心肌梗死后梗死邊緣區和非梗死區瞬間外向鉀電流影響的研究

張鐵軍 張旭妍 苗華為 菅鵬輝 李霞 董燕平 封亞麗

研究表明，急性心肌梗死后左心室心肌細胞可發生電生理異質性改變，特別是在不同部位，如梗死邊緣區和非梗死區細胞之間電生理差異性更加明顯，是引起惡性心律失常，從而導致心源性猝死的主要因素之一。本文擬通過全細胞膜片鉗記錄方法觀察阿托伐他汀對急性心肌梗死后兔心肌梗死區邊緣區和非梗死區單個心外膜心室肌細胞(Epicardium，Epi)進行研究，以進一步了解阿托伐他汀對心肌梗死后梗死邊緣區和非梗死區細胞離子通道的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 本研究選用新西蘭純種大耳白兔30 只，以上動物均由河北醫科大學實驗動物中心購買，雌雄不拘，質量1.5 ～2.0 kg。隨機分為3 組，每組10 只。分別為正常對照組(CON 組)，其他兩組均采用結扎兔左前降支方法［1］以建立心肌梗死模型后一組為心肌梗死組(AMI 組)分離左心室心肌梗死部位梗死邊緣區(AMI-R)和非梗死區(AMI-N)細胞，另一組為阿托伐他汀組，從手術日開始連續口服阿托伐他汀(5 mg·kg－1·d－1)，共7 d，后分離AMI-R 和AMI-N 細胞。阿托伐他汀由輝瑞公司生產。

1.2 血脂水平測定 以上3 組均在手術建立模型前抽取靜脈血，用生化分析儀測定血清總膽固醇。

1.3 實驗方法

1.3.1 液體配置:參見文獻［2］中微電極電極內液成分:KCl 140，MgCl20.53，EGTA 10，HEPES 10，采用KOH 調節pH 值至7.3。電極外液:在無鈣臺氏液基礎上，增加BaCl2用于阻斷內向整流鉀電流，增加氯化鈷用以阻斷鈣電流和鈣依賴性瞬間外向鉀電流(Ito2)。

1.3.2 梗死區和非梗死區心室肌細胞分離:心肌梗死模型存活1 周時采用猝擊兔頭顱枕部方式致昏后迅速開胸切取心臟，置于4℃恒溫無鈣臺氏液中，迅速連接在Langendorff 心臟灌流裝置上，經主動脈根部逆行用無鈣臺氏液灌流10 min，將含Ⅰ型膠原酶、牛血清蛋白的無鈣臺氏液反復灌流心臟8 ～10 min，采用眼科剪仔細剪下梗死邊緣區和非梗死區［2］心室肌組織:距梗死區邊緣2 ～4 mm 心室壁，以眼科剪、眼科鉗將心室壁橫向解剖，心外膜細胞位于為緊鄰心外膜側1.0 ～1.5 mm 心肌，精確剪取并剪碎，置于稀釋1 倍的酶液中攪拌，在保證氧氣沖入條件下，保持恒溫36℃分離細胞，靜止4 ～5 min 后取細胞懸濁液可于鏡下看到存活的心肌細胞，過濾并離心保存在KB 液中保存，待1 h后細胞膜恢復狀態后可記錄電流。

1.3.3 心室肌細胞封接與全細胞膜片鉗記錄模式的建立:參考文獻建立全細胞記錄模式后［2］，待記錄微電極阻抗達2 ～3 MΩ 時，吸取已靜置的心室肌細胞懸液滴于灌流槽中，待心室肌細胞沉底附壁后，灌流液充分灌流沖去酶液，鏡下選取立體感強、表面光潔、橫紋清晰的桿狀心室肌細胞為細胞封接對象。利用三維液壓微操縱器將記錄微電極靠近細胞膜進行封接，給予負壓吸引，待封接阻抗達1 GΩ 以上時，再采用較大負壓吸破細胞膜，同時補償電容電流和電極串聯電阻，形成全細胞記錄模式。通過pulse +pulsefit 軟件控制脈沖信號，通道信號經EPC-9 膜片鉗放大器放大，通過電極絲和微電極傳導入心室肌細胞內，EPC-9 膜片鉗放大器轉換刺激細胞產生的電流信號后，經pulse +pulsefit 軟件分析。實驗過程保持室溫恒定于20 ～25℃，為減少系統誤差，均于細胞破膜后穩定2 min 開始記錄細胞電流信號。分別記錄以上3 組的Epi 心肌細胞Ito 電流。為降低細胞間誤差，電流值以電流密度(pA/pF)表示。

1.3.4 Ito 的記錄方法:①電流-電壓曲線(I-V 曲線):首先將細胞鉗制于－ 50 mV 電壓，后超極化至－160 mV電壓，持續50 ms，然后去極化至－40 mV 電壓，使鈉離子通道失活，于50 ms 后去極化脈沖從－30 mV電壓躍升至+70 mV 電壓，階躍為10 mV 電壓，整個時程為250 ms。將不同鉗制電壓下的Ito 強度繪成I-V 曲線。分別記錄CON 組、AMI 組和阿托伐他汀組的I-V 曲線及鉗制電壓為+70 mV 時的電流，并進行組間比較。②失活曲線的電壓誘導方案:先將細胞鉗制在－50 mV，超極化至－ 100 mV，持續250 ms，階躍10 mV，至－40 mV，去極化至+70 mV，持續250 ms，階躍10 mV。將記錄的Ito 與最大激活時的Ito 之比，與相應的條件脈沖膜電位作圖得Ito 通道失活曲線。

1.4 統計學分析 應用SPSS 15.0 統計軟件，計量資料以± s 表示，3 組間比較采用方差分析，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組血脂測定 CON 組、AMI 組和阿托伐他汀組血清總膽固醇分別為(1.81 ±0.29)、(2.0 ±0.12)、(1.95 ±0.12)mmol/L，3 組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。

2.2 心外膜細胞Ito 電流I-V 曲線的變化 3 組細胞電流密度于+70 mV 電壓時達峰值，AMI 組較CON 組Epi 的I-V 曲線整體呈下降趨勢，CON 組于+70 mV電壓時Ito 電流密度為(115.8 ±6.0)pA/pF (n=15 cells)明顯高于AMI 組中梗死邊緣區(52.75 ±9.94)pA/pF(n =12 cells)和AMI 組非梗死區的Ito 電流密度(72.29 ±8.74)pA/pF (n =15 cells)，差異有統計學意義(P ＜0.01)。AMI 組中梗死邊緣區和非梗死區心外膜電流密度之間存在差異有統計學意義(P ＜0.05)。阿托伐他汀組中梗死邊緣區和非梗死區的心外膜細胞電流密度在+70 mV 電壓的Ito 電流密度分別較AMI 組上升，分別為(80.27 ±2.19)pA/pF(n =13 cells)、(86.15 ±2.64)pA/pF(n=13 cells)，2 者之間比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。圖3 為CON組、阿托伐他汀組梗死邊緣區和非梗死區的心外膜細胞Ito 細胞電流圖。見圖1 ～3。

2.3 心外膜細胞Ito 電流Ito 失活曲線比較 CON 組心外膜細胞的Ito 失活曲線在－30 mV 完全失活，半數失活電壓(V0.5)為(－68.46 ±7.53)mV (n =12 cells)，AMI 組梗死邊緣區和非梗死區的心外膜細胞的Ito 失活曲線在－20 mV 完全失活，兩者V0.5 分別為(－59.92 ±7.48)mV (n =11 cells)和(－56.55 ±9.10)mV (n =13 cells)，CON 組、AMI 組梗死邊緣區和非梗死區的心外膜細胞的失活曲線趨勢之間無明顯變化，CON 組與AMI 組非梗死區半數失活電壓比較差異有統計學意義(P ＜0.05)，AMI 組梗死區和梗死邊緣區的心外膜細胞的半數失活電壓比較無統計學意義(P ＞0.05)。阿托伐他汀組梗死邊緣區和非梗死區的心外膜細胞失活曲線均在－30 mV 完全失活，兩者細胞V0.5 分別為(－64.64 ±7.53)mV (n =11 cells)和(－62.70 ±6.64)mV (n =13 cells)，差異無統計學意義(P ＞0.05)。

圖1 CON 組、AMI 組梗死邊緣區和非梗死區的心外膜細胞Ito 細胞電流圖

圖2 CON 組、AMI 組梗死邊緣區和非梗死區的心外膜細胞Ito I-V 曲線

圖3 CON 組、阿托伐他汀組梗死邊緣區和非梗死區的心外膜細胞Ito I-V 曲線

3 討論

研究證實，他汀類藥物是羥基-3 甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)抑制劑，他汀類藥物的作用除了降低血脂以外，還有非降脂作用，其中有抗心律失常作用［3］，但他汀類對于心肌梗死后抗心律失常的離子通道機制作用尚未不確切。

心肌細胞動作電位為細胞膜中多種離子通道順序啟動及關閉的整體作用的結果［4］。本研究證實，兔急性心肌梗死后左心室游離壁心外膜梗死邊緣區和非梗死區Ito 電流密度存在明顯差異，梗死邊緣區及非梗死區Epi 細胞Ito 的失活曲線右移，失活變的緩慢，以上變化會導致左心室心肌梗死區邊緣區和非梗死區心外膜動作兩個不同部位的電位平臺期出現不一致性，從而使心室肌細胞不同部位之間復極過程的離散度增加，梗死區邊緣區和非梗死區之間存在電生理差異性增加［5］可誘發Ito 所介導的2 相折返機制從而引起室性心律失常的發生。

本研究證實阿托伐他汀能使兔急性心肌梗死邊緣區和非梗死區心外膜細胞下降的Ito 密度增加，右移的穩態失活曲線左移，減輕心室肌細胞Ito 不同區域之間的電壓梯度差異，緩解了梗死區邊緣區和非梗死區心肌細胞與供血正常區心外膜心肌細胞之間Ito 差異所造成的電生理異質性，從而減少由Ito 所介導2 相折返的機會，從而證實阿托伐他汀改善急性心肌缺血而可能引發的折返性室性心律失常的發生。

表明阿托伐他汀降低AngⅡ、TNF-α 的表達水平，抑制心肌梗死后心室結構重構，保護受損心室肌功能，從而減輕心室肌細胞電生理異質性，達到減少室性心律失常的發生［6］。在急性心肌梗死初期盡應用阿托伐他汀緩解可緩解心室肌細胞的離子通道異常機制與他汀類藥物在穩定斑塊、調節血脂的基礎上，通過改善血管內皮細胞功能、抑制炎性反應、緩解減少心肌梗死面積和無復流［7］作用有關。有研究表明，阿托伐他汀可通過抑制凋亡關鍵酶降低了心肌細胞凋亡數目［8］，同時具有改變心肌梗死后心室肌部分細胞膜離子通道的活性［9］達到抗心律失常的作用。

1 張鐵軍，李佃貴，張彩萍，等.化濁解毒活血方對兔心肌梗死1 周后瞬間外向鉀電流跨壁異質性的影響.遼寧中醫雜志，2011，3:555-556.

2 張鐵軍，李佃貴，張彩萍，等.黃芪對兔急性心肌梗死左室心外膜細胞瞬間外向鉀電流影響的研究.河北醫藥，2009，31:3199-3201.

3 邊波，孫躍民，萬征.他汀類藥的抗心律失常作用:從臨床循證證據到分子機制.中國心臟起搏與心電生理雜志，2009，23:377.

4 Antzelevitch C，Dumaine R.Elenctrical heterogeneity in the heart:physiological pharmacological and clinical implication//Hand book of physiology.The Cardiorvascular System.The Heart Am Physiol Soc，2002，1:654-692.

5 Perrier E，Kerfant BG，Lalevee N，et al.Mineralocorticoid receptor antagonism prevents the electrical remodeling that precedes cellular hypertrophy aftermyocardial infarction.Circulation，2004，110:776-783.

6 吳帆，孫立強，劉宗芳，等.阿托伐他汀對大鼠心肌梗死后AngⅡ、TNF-α 及心功能的影響.實用診斷與治療雜志，2006，20:8-10.

7 Zhao JL，Yang YJ，Cui CJ，et al.Pretreatment with simvastatin reduces myocardial no-reflow by opening mitochondrial K(ATP)channel.Br J Pharmacol，2006，149:243-249.

8 張瓊，陳書艷.阿托伐他汀對大鼠心肌急性缺血細胞凋亡及caspase-3 因表達影響.中華實用診斷與治療雜志，2010，24:965-967.

9 Tamargo J，Caballero R，Gomez R，et al.Lipid-lowering therapy with statins，a new approach to antiarrhythmic therapy.Pharmacol Ther，2007，114:107-126.