氧化苦參堿聯合順鉑對卵巢癌Bcl-2、Bax 表達的影響

王東暉 史春燕 李霞 劉丹彤 高潔凡 馮靜 王曉紅

卵巢癌是嚴重威脅女性生命的惡性腫瘤，目前臨床常用治療手段主要是手術和化療，而鉑類是卵巢癌化療方案中最常用的藥物，但是腫瘤細胞對鉑類的耐藥性及其毒副作用往往導致化療方案難以順利實施。因此，尋找對化療藥物具有減毒或增效作用的輔助用藥至關重要。氧化苦參堿是從豆科植物苦參中提取分離的一種生物堿，藥理作用廣泛［1］。目前，氧化苦參堿的抗腫瘤活性受到了廣泛關注并進行了大量的機制研究［2，3］。但氧化苦參堿用于卵巢癌的研究報道較少，本課題將對苦參堿輔助臨床化療治療卵巢癌進行實驗研究，并對其作用機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2 月齡雌性Fisher344 大鼠60 只，SPF 級，體重130 ～160 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號SCXK(京)2012 －0001。

1.2 試劑 氧化苦參堿膠囊，正大天晴制藥公司;順鉑，齊魯制藥有限公司生產;NuTu-19 細胞株，上海豐壽實業有限公司。卵巢癌SKOV3 細胞，購于吉妮歐生物科技公司。氧化苦參堿注射液購于正大天晴制藥公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)為Sigma 公司產品。Annexinv-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒，購于上海碧云天生物技術研究所。Bcl-2、Bax 一抗購于Abcam 美國公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與給藥［4］:NuTu-19 細胞株用含10%胎牛血清的PRIM-1640 培養基培養，胰酶消化后，用培養基洗滌，計數后用0.9%氯化鈉溶液制備成2 ×107/ml 細胞懸液。按0.2 ml/只接種于Fisher344 大鼠右側腋部皮下(留出10 只作為正常對照組)。7 d 后，將荷瘤大鼠隨機分為5 組:模型組(灌胃蒸餾水，腹腔注射0.9%氯化鈉溶液)、順鉑組(灌胃蒸餾水，腹腔注射順鉑3 mg/kg，隔日注射1 次)、順鉑+氧化苦參堿低劑量組(灌胃氧化苦參堿40 mg/kg，隔日腹腔注射1 次順鉑3 mg/kg)、順鉑+氧化苦參堿中劑量組(灌胃氧化苦參堿80 mg/kg，隔日腹腔注射1 次順鉑3 mg/kg)、順鉑+氧化苦參堿高劑量組(灌胃氧化苦參堿160 mg/kg，隔日腹腔注射1 次順鉑3 mg/kg)每組10 只。療程12 d。

1.3.2 檢測指標:給藥結束后，10%水合氯醛麻醉，摘取腫瘤組織，稱重，計算抑制率，抑制率=(模型組平均瘤重－ 治療組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%。稱取100 mg 腫瘤組織，70%乙醇固定，制成單細胞懸液，碘化丙啶染色，流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡率。

1.3.3 細胞培養及分組:在37℃、5% CO2培養箱內，用含10%胎牛血清的1640 培養基常規培養卵巢癌SKOV3 細胞。細胞融合80%左右時，0.25%胰酶消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。將SKOV3 細胞分為空白對照組、順鉑組、順鉑與氧化苦參堿聯用3 個劑量組，順鉑終濃度為3 μg/ml，氧化苦參堿終濃度分別為2.5 mg/ml、5.0 mg/ml、10.0 mg/ml，每組10 個復孔。

1.3.4 MTT 法檢測SKOV3 細胞增殖［5］:取對數生長期細胞，胰酶消化，臺盼藍計數，調整細胞濃度為5 ×106個/ml，每孔加細胞懸液200 μl，置37℃、5% CO2培養箱培養24 h，分別加入相應藥物，空白對照組加入等量培養基。加藥48 h 后，加入MTT 20 μl(濃度為2 g/L)，繼續培養4 h。丟棄培養基，每孔加入200 μl DMSO，震蕩1 min，藍色晶體完全溶解后用酶標儀于570 nm 處檢測吸光度(OD 值)，并計算抑制率:抑制率=(空白對照組OD 值－用藥組OD 值)/空白對照組OD 值×100%。

1.3.5 流式細胞術檢測SKOV3 細胞周期［6］:取對數生長期細胞，胰酶消化，臺盼藍計數，調整細胞濃度為5 ×106個/ml，按5 ml/瓶移至無菌培養瓶中，每組6瓶，培養24 h 后加藥，空白對照組加入等量培養基。繼續培養48 h。胰酶消化，收集細胞，PBS 洗2 遍，70%乙醇固定2 h，PI 避光染色30 min，300 目尼龍網過濾，流式細胞儀進行檢測細胞周期及凋亡率。

1.3.6 Western blot 檢測SKOV3 細胞Bcl-2、Bax 蛋白表達:細胞裂解后收集蛋白，考馬斯亮藍法定量蛋白。SDS-PAGE 電泳轉膜，5% 脫脂奶粉封閉2 h。加入TTBS 稀釋(1∶500)的一抗/β-actin(1∶1 000)稀釋液，4℃過夜。洗膜后，加入TTBS 1∶10 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫反應2 h。化學發光法檢測蛋白條帶。Labworks 軟件對條帶進行吸光度積分掃描，用目的蛋白灰度值/β-actin 內參照膠片灰度值的比值為蛋白的相對表達量，進行統計分析。

1.4 統計學分析 應用SPSS 11.5 統計軟件，計量資料以± s 表示，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氧化苦參堿對順鉑化療卵巢癌大鼠腫瘤重量的影響 與模型組相比，各治療組腫瘤重量均明顯降低(P ＜0.01);與順鉑組相比，氧化苦參堿80 mg/kg 及160 mg/kg 2 組腫瘤重量顯著降低(P ＜0.05);氧化苦參堿輔助治療各組腫瘤抑制率均有所升高。見表1。

2.2 氧化苦參堿對順鉑化療卵巢癌大鼠腫瘤組織細胞凋亡率的影響 與模型組相比，各治療組腫瘤組織細胞凋亡率均明顯升高(P ＜0.05);與順鉑組相比，氧化苦參堿輔助治療各組凋亡率均有不同程度的升高，尤以160 mg/kg 組最為明顯(P ＜0.05)。見表2。

表1 氧化苦參堿對順鉑化療卵巢癌大鼠腫瘤重量的影響n =10

表2 氧化苦參堿對順鉑化療卵巢癌大鼠腫瘤組織細胞凋亡率的影響 n =10

2.3 氧化苦參堿聯合順鉑對SKOV3 細胞增殖的影響MTT 法顯示，聯合化療組能夠明顯抑制SKOV3 細胞增殖，且能增強順鉑的抑制作用，其中氧化苦參堿5.0 mg/ml、10.0 mg/ml 劑量組與順鉑組比較，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表3。

表3 氧化苦參堿聯合順鉑對SKOV3 細胞增殖的影響n =10

2.4 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3 細胞周期的影響 與空白對照組相比，各用藥組G0/G1 期細胞均增多(P ＜0.01)，且氧化苦參堿3 個劑量均能增強順鉑的作用(P ＜0.05);與空白對照組相比，S、G2/M 期細胞均減少，其中G2/M 期細胞減少尤為明顯(P ＜0.01)，氧化苦參堿5.0 mg/ml、10.0 mg/ml 組與順鉑組相比明顯降低(P ＜0.05);與空白對照組相比，各用藥組SKOV3 細胞均顯著升高(P ＜0.01)，而氧化苦參堿10.0 mg/ml 組較順鉑組升高尤為明顯(P ＜0.05)。見表4。

表4 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3 細胞周期的影響 n =6 ± s

表4 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3 細胞周期的影響 n =6 ± s

注:與對照組比較，* P ＜0.01;與順鉑組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M 凋亡率(%)47 ±6 40 ±5 13.0 ±2.0 3.2 ±0.5順鉑組 56 ±4* 36 ±4 7.5 ±1.2* 28.3 ±5.7*順鉑+氧化苦參堿2.5 mg/ml 64 ±6＊△ 31 ±4* 5.3 ±1.4* # 30.8 ±6.2*順鉑+氧化苦參堿5.0 mg/ml 65 ±5＊△ 30 ±4* # 5.1 ±1.3＊△ 34.7 ±5.9*順鉑+氧化苦參堿10.0 mg/ml 68 ±7* # 27 ±4＊△ 4.8 ±1.1＊△ 38.3 ±6.7*#對照組

2.5 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3 細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 與空白對照組相比，各用藥組Bcl-2蛋白表達均顯著下調(P ＜0.05)，而Bax 蛋白表達均顯著上調(P ＜0.05);與順鉑組相比，氧化苦參堿5.0 mg/ml、10.0 mg/ml 組Bcl-2 蛋白表達顯著下調(P ＜0.05)，氧化苦參堿10.0 mg/ml 組Bax 蛋白表達顯著上調(P ＜0.05)。見表5。

表5 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3 細胞Bcl-2、Bax 相對蛋白表達量的影響 n =3，± s

表5 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3 細胞Bcl-2、Bax 相對蛋白表達量的影響 n =3，± s

注:與對照組比較，* P ＜0.05，#P ＜0.01;與順鉑組比較，△P ＜0.05，☆P ＜0.01

Bcl-2 Bax對照組組別0.67 ±0.03 0.36 ±0.04順鉑組 0.55 ±0.04* 0.48 ±0.05*順鉑+氧化苦參堿2.5 mg/ml 0.52 ±0.03# 0.53 ±0.05#順鉑+氧化苦參堿5.0 mg/ml 0.43 ±0.04#△ 0.58 ±0.06#順鉑+氧化苦參堿10.0 mg/ml 0.40 ±0.03#☆ 0.61 ±0.04#△

3 討論

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見惡性腫瘤之一，上皮性卵巢癌病死率占婦科腫瘤首位，嚴重威脅著女性患者的生命。NuTu-19 是從Fisher344 大鼠卵巢表面上皮細胞體外培養20 代后出現的，具有接觸抑制消失、染色體核型改變、成瘤性等惡性細胞的特性，屬于一種上皮性卵巢癌細胞系［7］，故本實驗選擇此細胞系建立大鼠卵巢癌實體瘤模型。實驗結果顯示，順鉑能夠有效抑制卵巢癌實體瘤的重量，而氧化苦參堿能夠增強順鉑的抑瘤作用。

細胞凋亡(apoptosis)是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，是機體清除衰老、損傷、突變細胞的重要方式。目前，很多學者認為細胞凋亡受抑是腫瘤發生的重要原因，而誘導細胞凋亡已經成為腫瘤治療的新靶標。迄今為止，國內外眾多科研人員借助分子生物學技術，就細胞凋亡做了大量的探索工作，提出了很多觀點和假說，但是仍然沒有找到有關細胞凋亡過程的確切機制［8］。研究表明，細胞凋亡和細胞周期有相關性，細胞周期阻滯于哪一期，凋亡就發生在哪一期［9］。細胞周期分為間期和分裂期兩個階段，細胞大部分生命活動時間是在間期度過的。間期又分為DNA 合成前期(G1 期)、DNA 合成期(S期)與DNA 合成后期(G2 期)。細胞增殖周期能否順利進行，主要取決于G1/S 轉換盒G2/M 轉換，這是調控細胞周期進程的2 個節點。本研究結果表明，順鉑能夠將卵巢癌SKOV3 細胞阻滯于G0/G1 期，使得進入S 期的細胞比例有所降低，而氧化苦參堿能夠增強順鉑對卵巢癌SKOV3 細胞的阻滯作用，并且隨濃度增高，G0/G1 期細胞比例逐漸升高，S 期細胞比例顯著降低，故我們推測，細胞凋亡主要發生在G1 期。凋亡的發生過程受到多種基因的調控，目前研究較多的有p53、caspase、Bcl-2 等。Bcl-2 是抗細胞凋亡蛋白的代表，Bax 是促細胞凋亡的代表，兩者相互拮抗，二者平衡時細胞正常生長［10］。隨著氧化苦參堿濃度的升高，Bcl-2 蛋白表達明顯降低，Bax 蛋白表達明顯升高，而細胞凋亡率也隨之升高，故我們推測氧化苦參堿誘導SKOV3 細胞凋亡與Bcl-2、Bax 蛋白表達失衡有關。

順鉑作為卵巢癌常用化療藥物，腫瘤細胞產生的耐藥性以及藥物本身的不良反應為臨床應用造成了一定障礙，本研究對氧化苦參堿用于卵巢癌化療輔助用藥有一定的參考價值，但仍然存在缺陷，如只觀察了藥物對卵巢癌SKOV3 一個時間點作用效果，未進行動態觀察來評價藥物作用與時間的關系，程度如何;順鉑只設一個劑量組，未進行氧化苦參堿能否降低順鉑IC50值的相關研究等，這些我們將在后續研究中進行完善。另外，氧化苦參堿對耐藥卵巢癌細胞株的作用、對其他卵巢癌細胞株的作用等一系列研究等待我們開展。我們將通過大量的研究工作來觀察氧化苦參堿能否在不影響療效的前提下降低化療藥物用量，增強化療效果，或增加腫瘤對化療藥物的敏感性。

1 鄭幼蘭，彭華毅.氧化苦參堿(苦參素)治療慢性乙型肝炎、肝纖維化的基礎與臨床.海峽藥學，2007，19:1-3.

2 Ling Q，Xu X，Wei X，et al.Oxymatrine induces human pancrealic cancer PANC-1 cells apoptosis via regulating expression of Bcl-2 and LAP families，and releasing of cytochrome.Exp Clin Cancer Res，2011，30:66.

3 Qin XG，Hua Z，Shuang W，et al.Effects of matrine on HepG2 cell proliferation and expression of tumor relevant proteins in vitro.Pharmaceutical Biology，2010，48:275-281.

4 鄒黨華，譚布珍，黃艷琴，等.小劑量雷公藤內酯對荷卵巢癌大鼠體內抑瘤作用的觀察.江西醫學院學報，2009，49:110-111.

5 司徒鎮強，吳軍正主編.細胞培養.第1 版.西安:世界圖書出版公司，1996.186-187.

6 郭啟帥，黃曦，李少林.苦參堿誘導卵巢癌SKOV3 細胞凋亡的機制研究.中國藥理學通報，2010，26:1104-1107.

7 Testa JR，Getts LA，Salazar H，et al.Spontaneous transformation of rat ovarian surface epithelial cells results in well to poorly differentiated tumors with a parallel range of cytogenetic complexity.Cancer Res，1994，54:2778-2784.

8 Yamashita S，Masuda Y，Kurizaki T，et al.Survivin expression predicts early recurrence in early-stage breast cancer.Anticancer Res，2007，27:2803-2808.

9 姜浩，樊光華.人參皂甙-Rh2 對人肝癌Bel-7404 細胞增殖和凋亡的影響.中國腫瘤臨床與康復，2004，11:289-292.

10 Cory S，Huang DC，Adams JM.The Bcl2 family:roles in cell survival and oncogenesis.Oncogene，2003，22:8590-8607.