一種簡單的甜瓜白粉茵單孢子分離方法

郭麗霞 張永兵 李寐華 張學軍

摘要：為了建立一種新的甜瓜白粉病病原菌單孢子分離方法，采用眉毛挑針挑取法，即在實體解剖鏡下，在水瓊脂培養基上直接挑取單個孢子進行活體分離純培養.結果表明，此方法簡單快速、操作方便、易于掌握，非常適用丁孢子較大且活體寄生的病原菌。首次建立了甜瓜白粉病單個孢子活體分離純培養的方法，為甜瓜白粉病生理小種及相關育種研究奠定了基礎。

關鍵詞：甜瓜；白粉病；單孢分離

甜瓜（Cucumi.s m.elo L.）為葫蘆科（CuCurbitace-ae）甜瓜屬（Cucumi.s Linn）一年生草本植物，是國內外重要的園藝作物和經濟作物。甜瓜白粉病是一種廣泛發生的世界性病害，在瓜類作物上均可嚴重發牛，甜瓜白粉病可導致植株冠層減少，單株坐果率降低，從而造成減產，且易使果實變小，導致商品價值降低，世界各國都十分重視甜瓜白粉病抗病育種工作。就目前所知，危害瓜類的白粉病菌有3個屬6個種，其中最主要的危害來自甜瓜白粉病瓜單囊殼白粉菌Poclosphaera xanthzi（原稱Sphaerothe-（ca fuliginea）和二孢白粉菌Golovinamyces cichora-cearum（原稱Erysiphc cichoracearum）；瓜類白粉病的生理小種多、分化快，僅單囊殼白粉菌就包含很多生理小種，目前已經發現的有11個生理小種，分別是小種0、1、2U.S、2France、3、4、5、Nl、N2、N3和N4；二孢白粉菌有2個生理小種，分別是小種0和。甜瓜白粉病是一種專性活體寄生菌，不能在人工培養基上分離培養，只能活體保存 至今還沒有關于甜瓜白粉病單孢子分離的研究報告，日.傳統保存方法不嚴謹，一般僅可保存菌種1個月，還容易造成小種交叉污染，這對生理小種眾多的甜瓜白粉病研究及抗病育種來說無疑是致命的，因而探索出一種合適的甜瓜白粉病菌單孢子分離方法，對病原菌長期保存、病原菌問互作及遺傳多樣性分析和分子標記輔助育種等至關重要。本文在借鑒前人在其他病原菌單孢分離的基礎上，采用眉毛挑針挑取法獲得了甜瓜白粉病單孢分離的純培養，

l 材料與方法

1.1材料

新鮮的白粉菌，解剖鏡，眉毛，牙簽若干，透明膠布一卷，剪刀，解剖刀，解剖針，鑷子，培養皿，吸水紙，移液器，記號筆，瓊脂粉，甘露醇，苯并咪唑，去離子水，75%乙醇（后同），硫酸霉素。供試甜瓜品種為‘伽師瓜。

1.2方法

1.2.1 水瓊脂（WA）的制備稱取12 g瓊脂粉，加入1 000 mL去離子水，121℃高壓滅菌20min，冷卻到45℃加入醫用硫酸霉素至終質量濃度50μg'mL-1.

1.2.2甘露醇培養基的制備稱取10g甘露醇、9g瓊脂粉、30mg苯并咪唑，加入1000mL去離子水，121℃高壓滅菌20mins，冷卻到45℃加入醫用硫酸霉素至終質量濃度50μg·mL-1。

1.2.3 眉毛挑針的制備拔取眉毛1～2根，用透明膠帶把眉毛粘到牙簽上，再用剪刀剪去前端0.5cm長度，注意，一定要用剪刀剪去眉毛前端，有利挑取分生孢子一

1.2.4 白粉病菌單孢子挑取方法營養缽中播種‘伽師瓜種子，室溫育苗。‘伽師瓜苗長出后的6～10d，田間采集白粉病葉，放在冰盒中，帶回實驗室處理.葉表面噴撒無菌水，4℃冰箱中過夜。將實驗需要的材料放在無菌操作臺中，紫外燈滅菌。然后把帶有白粉病菌葉片在超凈工作臺邊緣用洗耳球吹入水瓊脂平板上，蓋上蓋，放解剖鏡下；取若干‘伽師瓜苗子葉，用75%的乙醇表面消毒.子葉吹十后，放入甘露醇培養基中；調整目鏡和物鏡距離，直到找到無色透明的白粉病菌孢子，眉毛挑針挑取單個白粉病菌分生孢子放在子葉上面，標記日期及實驗內容二放入培養箱，白天22℃，夜晚18℃，12h光周期培養。7d以后開始觀察，記錄結果。

2 結果與分析

如圖1所示，菌落單一，生長良好，已經獲得白粉菌單孢子純培養。培養7d（圖1-A）病原菌已經侵染顯現出病癥；培養10d病原菌緩慢生長，孢子堆逐漸變大（圖l-B）；培養14d病原菌生長快速，已近開始影響子葉，子葉開始變黃（圖1-C）。

3 討論與結論

關于病原菌單孢子分離培養的研究取得了一定進展，但是主要是集中在其他作物上的能在人工培養基上培養的一些病原菌。孫廣宇等針對黑粉菌的病原菌鏈隔孢在解剖鏡下進行單孢子分離取得了很好的效果；林代福用眉毛挑針法對水稻稻瘟病單孢子分離簡單、易行、無污染；張昊等用平板稀釋劃線法解決了體積小、顏色淡等鐮刀菌類型的單孢子分離技術。甜瓜白粉病是活體寄生，病原菌單孢子分離技術一直處于空白，本文首次報道了甜瓜白粉菌單孢子分離方法，方法簡單易行，準確無誤。

由于甜瓜白粉菌單孢子眉毛挑針分離方法是把分生孢子吹到水瓊脂上迸行挑取，很難保證每次挑取的單孢子都具有活性，需要挑取大量的單孢子，工作量相應會增加，如何能夠保證每次都能挑取有活力的白粉菌分生孢子需要進一步研究。

甜瓜白粉病菌單孢子分離的成功運用對今后甜瓜白粉病菌毒性變異及寄主病原互作的各類相關研究、病原菌遺傳多樣性分析、甜瓜抗病育種分子標記、聚合育種及甜瓜抗性基因定位、克隆等研究具有重大意義，同時該方法對其他作物白粉病單孢子分離具有借鑒指導意義。