新疆“生命營養液”體外抗HIV—1活性的分析

陳建國 梁寒峭 吾布利·卡地爾 趙婷 程池

摘要 [目的]研究新疆“生命營養液”體外抗HIV-1活性，并對其作用機制進行初步探討。[方法]采用MTT比色法，檢測“生命營養液”的細胞毒性；用攜帶熒光素酶基因的HIV-1假病毒感染體系，檢測“生命營養液”體外抗HIV-1活性，分析“生命營養液”體外抗HIV-1機制。[結果]“生命營養液”抑制HIV-1感染活性的半數有效濃度（IC50）為1.784 mg/ml，治療指數（TI）為7.22，其作用方式更接近于整合酶抑制劑MK-0518。[結論] “生命營養液”具有抗HIV-1活性，其作用機制可能抑制病毒的整合。

關鍵詞 “生命營養液”；HIV-1；假病毒；熒光素酶；機制

中圖分類號 S-03 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-008-02

艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS），由人類免疫缺陷病毒HIV引起。目前，高效抗逆轉錄病毒療法是目前臨床廣泛使用的治療艾滋病的方法，但此療法價格昂貴， 毒副作用大，而且易引起病毒產生變異性和耐藥性[1-2]。近些年來，人們不斷從天然植物中分離得到許多具有抗HIV活性的成分（例如黃酮類、生物堿類、香豆素類、木脂素類、多糖等化合物）[3-9]。這些天然成分具有專屬性強、毒副作用少等優點，現已成為抗HIV藥物研究的新趨勢。

“生命營養液”以核桃、巴旦木、杏仁、黃豆、綠豆、大米、干鮮果類和蔬菜類等50多種新疆地區特產的天然果蔬為原料，結合傳統工藝與現代生物技術，經過獨特的發酵工藝制備而成。它是一種新疆地區特色的具有保健功能的飲料[10]。

在新疆地區，維吾爾族民間常飲用“生命營養液”，具有增強免疫力、抗病毒、抗氧化、促進細胞再生、抑菌等功能[10-11]，也常作為輔助治療艾滋病的保健飲品。但是，目前仍缺乏對“生命營養液”的深入研究，尚無有關“生命營養液”抗HIV病毒的報道。因此，筆者采用體外細胞模型，初步分析“生命營養液”體外抑制HIV-1的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

“生命營養液”，由新疆埃杜升（ ALDOS） 生物開發有限公司提供。胎牛血清為 GIBICO、DMEM和RPMI 1640培養基，均購自美國 Invitrogen 公司。非核苷類逆轉錄酶抑制劑Efavirenz（EFV）和整合酶Raltegravir （MK-0518）均由NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供。DNA轉染試劑Lipofectamine 2000、DNA提取試劑TRIZOL購自美國Invitrogen公司。熒光素酶活性測定試劑盒Luciferase Assay System購自美國Promega公司。質粒小提試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國 TIgma 公司。pNL4.3.Env-.Luc質粒由中國醫學科學院岑山教授提供；pHCMV-G （VSV-G）質粒由美國Johnny He教授提供。

1.2 儀器

紫外分光光度計SmartSpecTM Plus spectrophotometer購自美國Bio-Rad公司。酶標儀Tristar LB 941、Centro XS3 LB 960均購自德國Berthold公司。Stratagene MX3000P熒光定量PCR儀購自Agilent公司。

1.3 “生命營養液”預處理

200 ml“生命營養液”經離心、過濾得到122.5 ml上清液，得率61.25%，凍干后得到1.84 g樣品。然后，將凍干粉溶于DMSO中，配成不同濃度的培養液，濃度分別為1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3和0.015 6 mg/ml，共7個稀釋度。

1.4 細胞培養

人胚腎上皮細胞293T用含10% FBS的DMEM培養基傳代培養。

人T淋巴細胞SupT1用含10% FBS的RPMI 1640培養基傳代培養。

1.5 HIV-1假病毒的制備

pNL4.3.Env-.Luc（表達具有熒光素酶報告基因，但包膜蛋白缺失的HIV-1病毒）和pHCMV-G （VSVG，水泡性口膜炎病毒外殼糖蛋白）共轉染293T產生的VSVG假型HIV-1病毒，-80 ℃保存。

1.6 “生命營養液”細胞毒性的測定

采用MTT法。按細胞數3×103/孔接種于96孔培養板，待24 h細胞貼壁后，分別加入不同濃度的藥物處理，濃度分別為1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3和0.015 6 mg/ml，共7個稀釋度。每個濃度設3個平行孔。藥物處理72 h后，除去上清液。每孔加入100 μl 500 mg/ml MTT，37 ℃孵育2 h后小心吸除培養液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，混勻，用酶標儀測定570 nm 吸收度（A），將各測試孔的A值減去本底A值（完全培養基加 MTT，無細胞）。

細胞存活率（%）=（加藥細胞A-本底A）/（對照細胞A-本底A）×100%

繪制抑制曲線，計算半數抑制（毒性）指數（TC50）。

1.7 “生命營養液”抑制HIV-1感染活性的評價

[12] SupT1

細胞接種96孔培養板，以MOI=1接種病毒，加入不同濃度的藥物處理，濃度分別為1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 3和0.015 6 mg/ml，設3組平行。然后，置于濃度5% CO2，37 ℃培養48 h，測定感染細胞中熒光素酶活性。取50 μl細胞懸液，加入2×裂解液50 μl，37 ℃孵育半個小時后，取其中5 μl細胞裂解液，加40 μl熒光素酶底物，在多功能微孔板檢測儀EnViTIon 2104-0010上測定熒光素酶活性，計算不同濃度樣品對病毒感染性的影響，并利用origin 軟件計算樣品抑制HIV-1活性的半數抑制指數（IC50）。應用治療指數（TI），評價“生命營養液”的抗HIV-1活性。

TI= TC50/IC50[13-14]

當TI>2時，為有效低毒；當1

1.8 “生命營養液”抗HIV作用機制的初步分析

[12] HIV侵襲靶細胞的主要過程為識別和黏附、膜融合、逆轉錄、整合和翻譯、裝配和釋放。一般，將整合以前歸為早期事件，之后為晚期事件。選用針對病毒復制不同時期的靶點明確的藥物，選取非核苷類逆轉錄酶抑制劑Efavirenz（EFV）和整合酶抑制劑Raltegravir （MK-0518）為陽性藥，選擇0、0.5、1、2、4、6、7和21 h作為加藥時間點，并且在感染病毒后確保病毒在同一時間進入生活周期，分別測出在不同時間點藥物對病毒復制的影響，從而初步判斷“生命營養液”抗HIV的作用機制。

2 結果與分析

2.1 “生命營養液”對人淋巴細胞SupT1細胞的毒性作用

采用MTT方法，測定不同濃度“生命營養液”對人淋巴細胞SupT1細胞的毒性。由圖1可知，“生命營養液”對SupT1細胞增殖的抑制率與其濃度呈現劑量依賴性關系，其TC50為0.247 mg/ml。

2.2 “生命營養液”抑制HIV-1感染的作用

由圖2可知，“生命營養液”對HIV-1感染的抑制率與其濃度呈現劑量依賴性關系，表明它具有一定的抗HIV-1的作用。其抑制HIV-1感染的IC50為1.784 mg/ml，TI為7.22，屬于有效低毒。

2.3 “生命營養液”抗HIV作用靶點的初步判定

由圖3可知，“生命營養液”的作用方式更接近于整合酶抑制劑MK-0518，同時對逆轉錄酶的活性也有一點影響，但對病毒的進入及其他早期環節沒有明顯影響。由此可知，“生命營養液”是通過抑制HIV-1的整合而發揮作用的。

3 結論

“生命營養液”是新疆地區特色的保健飲品，具有多種重要的生理活性。該研究首次對“生命營養液”抗HIV-1病毒作用進行了初步分析。結果表明，“生命營養液”對艾滋病毒HIV-1感染有抑制作用，IC50為1.784 mg/ml，TI為7.22，屬于有效低毒。該研究采用非核苷類逆轉錄酶抑制劑efavirenz（EFV）和整合酶Raltegravir （MK-0518）為陽性對照藥。研究表明，“生命營養液”抑制HIV-1感染的方式更接近于整合酶抑制劑MK-0518，說明它可能通過抑制HIV-1病毒的整合而發揮作用。

“生命營養液”雖被證實具有體外抗HIV-1的作用，但仍有許多問題亟待解決。首先，它發揮抗HIV-1作用的主要物質需要深入研究；其次，需要通過動物模型，研究它對免疫功能低下的調節作用、劑量關系；最后，還應加強對它發揮增強免疫力作用內源性分子靶點及信號通路的研究，只有在分子水平上研究其機制，才能發現問題的本質。

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