蛋白核小球藻無(wú)菌培養(yǎng)體系的建立

周琨　盧其能　岳明

摘要 [目的] 為了建立蛋白核小球藻無(wú)菌培養(yǎng)體系。[方法] 選取卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、潮霉素和頭孢霉素6種常用抗生素，比較蛋白核小球藻的除菌和純化效果。同時(shí)，對(duì)比蛋白核小球藻對(duì)不同濃度的卡那霉素和潮霉素的耐受性以及單獨(dú)使用卡那霉素和潮霉素的多次除菌效果。[結(jié)果] 卡那霉素和潮霉素對(duì)涂布帶菌藻液的抑菌和除菌效果明顯，其他4種抗生素的抑菌效果較差；小球藻對(duì)不同抗生素的耐受性不同，蛋白核小球藻對(duì)潮霉素敏感，50 mg/L就可以明顯抑制其的生長(zhǎng)，而對(duì)卡那霉素的敏感性要低得多，在200 mg/L時(shí)其生長(zhǎng)受到顯著抑制。[結(jié)論] 考慮到高濃度卡那霉素對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的抑制作用，最終確定用50 mg/L卡那霉素連續(xù)3次除菌處理的方式建立蛋白核小球藻的無(wú)菌培養(yǎng)體系；同時(shí)，測(cè)得純化培養(yǎng)的蛋白核小球藻藻液在685 nm處具有最大吸收峰，在此波長(zhǎng)下小球藻的細(xì)胞濃度與吸光值呈線性相關(guān)，可用A685來(lái)估測(cè)蛋白核小球藻濃度。

關(guān)鍵詞 蛋白核小球藻；除菌；體系

中圖分類號(hào) S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）19-014-04

小球藻（Chlorella）是一種單細(xì)胞綠藻，屬真核藻類。我國(guó)常見的種類有蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、橢圓小球藻（Chlorella ellipoidea）和普通小球藻（Chlorella vulgaris）等[1]。小球藻分布廣，光合效率高，易于培養(yǎng)，可快速繁殖和生長(zhǎng)[2-3]，且細(xì)胞內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素和蝦青素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有重要的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值[4-6]。

微生物研究中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)就是建立無(wú)菌培養(yǎng)體系。藻類也是如此。雜菌會(huì)給試驗(yàn)數(shù)據(jù)帶來(lái)誤差，甚至還會(huì)有假陽(yáng)性結(jié)果[7]。蛋白核小球藻的細(xì)胞壁上極易吸附細(xì)菌，不易除去[8]。除菌與否能明顯影響小球藻的生長(zhǎng)特點(diǎn)。從生長(zhǎng)曲線來(lái)看，未除菌小球藻與除菌后小球藻的生長(zhǎng)速度大致相同，在曲線達(dá)到穩(wěn)定期后它們的最大細(xì)胞密度相差不多。但是，未除菌小球藻在培養(yǎng)數(shù)天后少量細(xì)胞有下沉現(xiàn)象，還會(huì)黏附于培養(yǎng)設(shè)備的底部和側(cè)壁，不易被搖起，顏色會(huì)從綠色向黃色變化。而經(jīng)過(guò)除菌處理的小球藻經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)也很少有細(xì)胞下沉，搖動(dòng)時(shí)下沉的細(xì)胞易浮起，顏色一直呈現(xiàn)鮮綠，老化明顯延遲。這可能是因?yàn)槲皆谛∏蛟寮?xì)胞表面的細(xì)菌會(huì)分泌能促使藻細(xì)胞老化的物質(zhì)[9]。另外，在以特定波長(zhǎng)的吸光度表示藻濃度時(shí)，細(xì)菌的存在還會(huì)給測(cè)定結(jié)果帶來(lái)正誤差。

研究表明，真核藻類細(xì)胞對(duì)多種常用抗生素不敏感，鏈霉素甚至可以促進(jìn)很多真核藻類細(xì)胞的生長(zhǎng)[10-11]。通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)目股兀眯∏蛟迮c其雜菌對(duì)抗生素敏感性的差異，在不對(duì)小球藻的生長(zhǎng)造成影響的情況下，殺死或抑制雜菌[12-13]。

為了獲得無(wú)菌的小球藻體系，選擇氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、頭孢霉素和潮霉素6種實(shí)驗(yàn)室常用抗生素，對(duì)比它們的除菌效果，再結(jié)合蛋白核小球藻對(duì)抗生素的敏感性，選擇適于蛋白核小球藻除菌的抗生素及其濃度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藻種

蛋白核小球藻購(gòu)于中科院水生生物研究所，編號(hào)為FACHB-9。

1.2 培養(yǎng)基及配制方法

1.2.1

液體培養(yǎng)基。BG-11培養(yǎng)基是藻類的通用培養(yǎng)基。1 L BG-11培養(yǎng)基中含硝酸鈉1.5 g、三水合磷酸氫二鉀3 mg、碳酸鈉20 mg、檸檬酸6 mg、檸檬酸鐵銨6 mg、乙二胺四乙酸1 mg、硼酸2.86 mg、四水合氯化錳1.81 mg、七水合硫酸鋅0.222 mg、

二水合鉬酸鈉0.29 mg、硫酸銅0.79 mg、六水合硝酸鈷0.049 2 mg、二水合氯化鈣36 mg、七水合硫酸鎂75 mg。各成分預(yù)先配制成儲(chǔ)備溶液，濃度為培養(yǎng)基中濃度的1 000倍，4 ℃儲(chǔ)存。儲(chǔ)備時(shí)，各取儲(chǔ)備液1 ml，定容至1 L，并調(diào)節(jié)pH至7，在121 ℃下滅菌25 min，冷卻，即得到BG-11培養(yǎng)基。

1.2.2 固體培養(yǎng)基。各取1 ml儲(chǔ)備溶液，并定容至1 L，稱取13 g瓊脂粉于培養(yǎng)基中，在充分混勻的狀態(tài)下調(diào)節(jié)pH至7，在121 ℃下滅菌25 min，趁熱分裝到12.5 cm培養(yǎng)皿中，并冷卻。

1.3 6種抗生素的除菌效果試驗(yàn)

將滅菌后的BG-11和濃度1.3%瓊脂培養(yǎng)基分裝到12.5 cm培養(yǎng)皿中，分別向其中加入6種抗生素，每種抗生素的濃度分別為50、100、200、400 mg/L，充分混勻后冷卻。

將蛋白核小球藻藻液均勻涂布在培養(yǎng)基表面后密封，放入光照培養(yǎng)箱中，在25 ℃、4 320 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)10 d，記錄各培養(yǎng)皿中菌落數(shù)量。

1.4 蛋白核小球藻對(duì)潮霉素和卡那霉素的耐受性試驗(yàn)

將滅菌后的BG-11培養(yǎng)基分裝到250 ml三角瓶中，分別加入潮霉素和卡那霉素。每個(gè)抗生素組都包括50、100、200、400 mg/L 4種濃度。將蛋白核小球藻藻液按5%比例接種到培養(yǎng)基中，密封好后放入光照培養(yǎng)箱中，在25 ℃、4 320 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)10 d后觀察。

1.5 潮霉素和卡那霉素多次除菌試驗(yàn)

將滅菌后的BG-11和濃度1.3%瓊脂培養(yǎng)基分裝到12.5 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中的抗生素分別為50 mg/L潮霉素、50 mg/L卡那霉素和100 mg/L卡那霉素，充分混勻后冷卻。

將蛋白核小球藻藻液均勻涂布在培養(yǎng)基表面后密封，放入光照培養(yǎng)箱中，在25 ℃、4 320 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)10 d，記錄各培養(yǎng)皿中菌落的數(shù)量。然后，將細(xì)菌接種到相同濃度抗生素的培養(yǎng)基中，如果沒有菌落則無(wú)需接種。將接種后的培養(yǎng)基以同樣的調(diào)節(jié)培養(yǎng)10 d，記錄各培養(yǎng)皿中菌落的數(shù)量。對(duì)于仍然有菌落出現(xiàn)的培養(yǎng)基，再重復(fù)上述操作。

1.6 藻液紫外-可見光譜的檢測(cè)

將除菌后的蛋白核小球藻藻液按5%比例接種到100 ml BG-11培養(yǎng)基中。在光照培養(yǎng)箱中以25 ℃、4 320 lx光照強(qiáng)度培養(yǎng)7 d，每天手搖3次。

移取3 ml藻液于1 cm比色杯中，以3 ml BG-11培養(yǎng)基為對(duì)照，掃描400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)藻液的紫外-可見光譜。

1.7 蛋白核小球藻繁殖時(shí)藻液pH的變化

將除菌后的蛋白核小球藻藻液接種到500 ml BG-11培養(yǎng)基中（按5%接種），在光照培養(yǎng)箱中以25 ℃、4 320 lx培養(yǎng)20 d，每天手搖3次。在培養(yǎng)期間，每天取5 ml藻液至試管中，測(cè)定藻液pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種抗生素對(duì)蛋白核小球藻的除菌效果

為了獲得純化的蛋白核小球藻體系，必須選擇合適的抗生素進(jìn)行殺菌或抑菌。為此，選擇卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、潮霉素和頭孢霉素6種實(shí)驗(yàn)室常用抗生素，分別考察不同濃度對(duì)蛋白核小球藻的除菌效果。

蛋白核小球藻在含有50～400 mg/L抗生素的固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)10 d后，共出現(xiàn)3種菌落，分別為橘紅色的細(xì)菌菌落、表面粗糙的白色菌落和透明的水泡狀菌落。含頭孢霉素的固體培養(yǎng)基較多出現(xiàn)橘紅色菌落，含鏈霉素和慶大霉素的培養(yǎng)基表面也有橘紅色菌落生長(zhǎng)，但個(gè)數(shù)少于含頭孢霉素的培養(yǎng)基。表面粗糙的白色菌落多出現(xiàn)在含頭孢霉素和鏈霉素的固體培養(yǎng)基表面，而在卡那霉素培養(yǎng)基表面略少一些。透明的水泡狀菌落較多地出現(xiàn)在鏈霉素培養(yǎng)基表面。

由表1可知，在6種抗生素中，鏈霉素、慶大霉素和氨芐青霉素對(duì)蛋白核小球藻藻液的除菌效果較差，濃度在400 mg/L時(shí)仍有菌落，在50 mg/L時(shí)菌落數(shù)量多于20個(gè)，不適宜用來(lái)單獨(dú)除菌。頭孢霉素與氨芐青霉素的抗菌譜相似，故數(shù)據(jù)接近，且頭孢霉素對(duì)蛋白核小球藻的除菌效果略好于氨芐青霉素。潮霉素和卡那霉素的除菌效果較明顯，卡那霉素在400 mg/L時(shí)培養(yǎng)基表面沒有菌落，潮霉素在200、400 mg/L時(shí)培養(yǎng)基表明沒有菌落，卡那霉素和潮霉素在低濃度時(shí)菌落數(shù)量也低于其他4種抗生素。因此，可以初步確定潮霉素或卡那霉素單獨(dú)使用作為蛋白核小球藻除菌的抗生素。

2.2 蛋白核小球藻對(duì)潮霉素和卡那霉素的耐受性

盡管潮霉素和卡那霉素都能夠達(dá)到除菌目的，但還必須考慮到蛋白核對(duì)它們的耐受情況。為此，分別考察了濃度為50、100、200、400 mg/L的潮霉素和卡那霉素對(duì)液體培養(yǎng)情況下小球藻的影響。

由圖1可知，蛋白核小球藻在含有50～400 mg/L抗生素的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，藻液顏色隨卡那霉素濃度的增加而明顯變淺，當(dāng)卡那霉素濃度為200和400 mg/L時(shí)藻液已經(jīng)基本無(wú)色，與最右邊空白對(duì)照組相比差別不大。當(dāng)卡那霉素濃度為50和100 mg/L時(shí)，藻液呈現(xiàn)一種介于黃色和綠色之間的顏色，表明在此濃度下卡那霉素對(duì)蛋白核小球藻也有一定的影響。

由圖2可知，當(dāng)潮霉素濃度為50 mg/L時(shí)藻液已經(jīng)接近無(wú)色，而當(dāng)高于50 mg/L時(shí)溶液顏色與空白組沒有明顯差異，說(shuō)明蛋白核小球藻對(duì)潮霉素較敏感，50 mg/L潮霉素已經(jīng)可以明顯抑制蛋白核小球藻的生長(zhǎng)。無(wú)論是50 mg/L潮霉素還是100或200 mg/L卡那霉素都不能使BG-11+1.3%瓊脂培養(yǎng)基表面不出現(xiàn)菌落，因此還必須研究卡那霉素或潮霉素的多次除菌效果。

2.3 卡那霉素和潮霉素多次除菌效果

由表1可知，50 mg/L潮霉素、100和200 mg/L卡那霉素已對(duì)小球藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，而在這些濃度水平下，一次除菌處理不能使固體培養(yǎng)基表面不出現(xiàn)菌落。因此，設(shè)計(jì)了卡那霉素和潮霉素多次除菌試驗(yàn)。由表2可知，50 mg/L潮霉素和50、100 mg/L卡那霉素經(jīng)過(guò)3次除菌處理后固體表面培養(yǎng)基均無(wú)菌落出現(xiàn)。考慮到高濃度卡那霉素對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的抑制作用，最終確定用50 mg/L卡那霉素連續(xù)3次除菌處理的方式建立蛋白核小球藻的無(wú)菌培養(yǎng)體系。

經(jīng)過(guò)上述除菌方法處理的蛋白核小球藻，再經(jīng)5次傳代培養(yǎng)（按10%接種，各代培養(yǎng)10 d），培養(yǎng)方式為BG-11培養(yǎng)基、25 ℃、日平均光照強(qiáng)度4 320 lx、每日手搖3次，徹底消除殘留抗生素影響，然后將藻液涂布在LB+濃度1.3%瓊脂固體培養(yǎng)基表面，在搖床中培養(yǎng)5 d（37 ℃，無(wú)光照），發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基表面無(wú)菌落出現(xiàn)，說(shuō)明蛋白核小球藻培養(yǎng)液內(nèi)無(wú)細(xì)菌存在。通過(guò)以上試驗(yàn)，成功地建立了小球藻的無(wú)菌培養(yǎng)體系。

2.4 蛋白核小球藻藻液的紫外-可見光譜

藻液濃度通常有兩種表示方法：一是計(jì)數(shù)，二是以合適波長(zhǎng)下A值作為濃度的參考。與計(jì)數(shù)相比，A值更加簡(jiǎn)便迅速，因此需要檢測(cè)蛋白核小球藻藻液的紫外-可見光譜以確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

由圖3可知，在波長(zhǎng)掃描范圍400～800 nm，從紫外區(qū)到500 nm范圍內(nèi)呈現(xiàn)一個(gè)寬而高的吸收帶，在600～800 nm區(qū)間內(nèi)有一個(gè)明顯的波谷，出現(xiàn)在640 nm附近，最高峰出現(xiàn)在685 nm，在650 nm處還有一個(gè)較明顯的肩峰。

呂旭陽(yáng)等[14]研究表明，在450～700 nm波長(zhǎng)下，小球藻細(xì)胞濃度與藻液吸光度之間均表現(xiàn)為極顯著的線性相關(guān)，可以通過(guò)測(cè)定藻液吸光度，然后通過(guò)對(duì)應(yīng)的直線回歸方程換算出培養(yǎng)液的藻細(xì)胞濃度。因此，確定A685表示藻細(xì)胞濃度。

2.5 蛋白核小球藻繁殖時(shí)藻液pH的變化

培養(yǎng)基pH能影響小球藻的生長(zhǎng)。研究表明，小球藻在pH為10左右的堿性環(huán)境下生長(zhǎng)最快，在中性環(huán)境下雖然也能生長(zhǎng)，但接種后有很長(zhǎng)的遲緩期。 小球藻的生長(zhǎng)也會(huì)影響到藻液pH的變化，表現(xiàn)為：

小球藻生長(zhǎng)會(huì)利用培養(yǎng)基中的NO-3，NO-3被吸收進(jìn)細(xì)胞的同時(shí)伴隨有H+的共轉(zhuǎn)運(yùn)，使得藻液pH上升。這個(gè)上升過(guò)程是有限度的，H+濃度的降低會(huì)抑制吸收，同時(shí)培養(yǎng)基中的消耗也會(huì)抑制這個(gè)過(guò)程，達(dá)到平衡時(shí)pH保持穩(wěn)定。由圖4可知，藻液的pH隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增大，在起始BG-11培養(yǎng)基的pH不同的情況下藻液最終的pH都穩(wěn)定在11。

王逸云[7]研究發(fā)現(xiàn)，以f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)一種海水小球藻（Chlorella sp. MACC/C95），藻液最終的pH穩(wěn)定在10左右。兩者的差異除了藻種的不同，還可能因?yàn)榕囵B(yǎng)基配方中緩沖體系的差異以及NaNO3含量不同，BG-11培養(yǎng)基中NaNO3含量為1.5 g/L，而1 L f/2培養(yǎng)基中只含有NaNO3 74.8 mg。這意味著在BG-11培養(yǎng)基中，藻細(xì)胞可以吸收更多的H+，最終pH也略高一些。

3 結(jié)論

使用卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、潮霉素和頭孢霉素6種抗生素用于蛋白核小球藻的除菌和純化效果比較。研究表明，卡那霉素和潮霉素對(duì)涂布帶菌藻液的抑菌和除菌效果明顯，其他4種抗生素的抑菌效果較差；小球藻對(duì)不同抗生素的耐受性不同，蛋白核小球藻對(duì)潮霉素敏感，50 mg/L就可以明顯抑制其生長(zhǎng)；而對(duì)卡那霉素的敏感性要低得多，在200 mg/L時(shí)其生長(zhǎng)才顯著受到抑制；考慮到高濃度卡那霉素對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的抑制作用，最終確定用50 mg/L卡那霉素連續(xù)3次除菌處理的方式建立蛋白核小球藻的無(wú)菌培養(yǎng)體系；同時(shí)，測(cè)得純化培養(yǎng)的蛋白核小球藻在685 nm處具有最大吸收峰，在此波長(zhǎng)下小球藻的細(xì)胞濃度與吸光值呈線性相關(guān)，可用A685來(lái)估測(cè)蛋白核小球藻濃度。

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