綠竹P5CS基因的擴增及序列分析

鐘浩　高貴賓　潘雁紅　吳良如

摘要 采用同源克隆方法從綠竹基因組中獲得2個P5CS基因組片段：DoP5CS1長度為2 178 bp，包含7個內含子和8個外顯子，外顯子編碼序列為976 bp，編碼325個氨基酸殘基，編碼蛋白分子量34.787 4 kD，等電點（PI）5.27，N端有一個氨基酸激酶超家族（Amino Acid Kinases （AAK） superfamily）功能區，C端有一個醛脫氫酶超家族（Aldehyde Dehydrogenase （ALDH） Superfamily）功能區；DoP5CS2大小與DoP5CS1外顯子序列相同為976 bp，相似性達99.6%，但缺失內含子，推測DoP5CS2為返座假基因。該研究為基因全長序列的獲取和功能分析以及通過分子生物學手段提高綠竹乃至其他竹類植物的抗逆性奠定基礎。

關鍵詞 綠竹；P5CS；克??；脯氨酸

中圖分類號 S188+.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-025-05

竹子屬禾本科（Gramineae）竹亞科（Bambusoideae）多年生常綠植物，四季常青，枝葉茂盛，是極其重要的非木材可再生林業資源，是園林綠化的重要植物。竹子喜溫暖怕風寒，喜濕潤怕干旱，喜肥，喜酸性怕堿性[1]。由于受各地氣溫的影響，大部分竹種在分布上具有明顯的地帶性和區域性，其中福建、江西、浙江和湖南4省為主要產區。竹子的栽培區域多集中在南方，雖然人們在“南竹北移”引種研究上作了大量工作，通過引種馴化，使一些竹種能夠在華北、西北等氣候較寒冷、干燥的地區生長，但溫度和水分一直是限制一些極具經濟價值和觀賞價值的竹種得不到進一步推廣種植的主要因子[2]；而且引種后需要采取一系列行之有效的栽培技術措施來改善不良的環境條件，以滿足竹子的生長發育，但存在環境可控性差、生產成本較高和竹林生長不良等問題。如何利用現代生物技術改變竹子自身，如通過轉基因等分子生物學手段的處理，改變竹子的生物學和生態學特性，使其主動適應不良環境[3]，提高抗逆性，已成為竹類植物遺傳改良的必然選擇。

植物在適應低溫、干旱等脅迫時，往往通過生理生化的變化來適應，包括脅迫響應的功能和基因調控[4]。如植物膜脂發生改變[5]、糖和脯氨酸含量增高[6-7]、蛋白質組成發生變化[8]以及葉綠體的超微結構發生改變[9]等，其中脯氨酸（Proline）在滲透平衡中起著重要的調節作用，對細胞的膨壓增加有保護作用[10]。Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase， P5CS）是脯氨酸合成限速酶。P5CS基因全長cDNA序列已經在許多植物，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、紫花苜蓿（Medicago sativa）、豇豆（Vigna aconitifolia）和鹽地堿蓬（Suaeda salsa）等被克隆并研究。而其基因組序列的研究較少，如在擬南芥基因組中克隆出P5CS基因序列（X86778），全長序列為5 789 bp，包含19個內含子和20個外顯子；在甘蔗（Saccharum officinarum）基因組中克隆出2 016 bp的P5CS基因組片段（EF620362），包含7個內含子和8個外顯子[11]。

筆者以經長期進化適應比較抗寒的大型叢生竹種綠竹（Dendrocalamopsis oldhami）為試材，通過P5CS基因的擴增、測序及序列分析，旨在為今后該基因全長序列及其功能研究奠定基礎，為竹子遺傳轉化、抗寒新品種培育及抗逆分子育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料綠竹嫩葉采自福建華安竹種園，采集時經變性硅膠快速干燥后帶回實驗室置于-70 ℃冰箱保存備用。

1.2 試劑

TA克隆載體pMD18-T Vector、Taq酶及PCR試劑購自TaKaRa公司，GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、氨芐抗生素、IPTG和X-Gal購自生工生物工程上海（股份）有限公司，大腸桿菌DH5α感受態細胞購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物

根據NCBI的GenBank與DDBJ數據庫中的P5CS基因比對結果中保守區的核苷酸序列[11]，采用生物學軟件Primer Premier 5.0分析設計引物，引物長度20～22 bp，GC含量45%，退火溫度53 ℃。引物由生工生物工程上海（股份）有限公司合成，序列

F1：5′-GATTCATCTGGTATATCCTGGG-3′；

R1：5′-TTACTCCCTCTTGGAATGAC-3′。

1.4 基因組DNA的提取

采用改良的CTAB法提取綠竹基因組DNA[12]，用Titertek-Berthold Colibri超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度，取1 μl在1%TAE瓊脂糖凝膠上檢測DNA的質量，然后定量至100 ng/μl，-20 ℃保存備用。

1.5 P5CS基因序列擴增與測序

上述基因組DNA 1 μl，10×PCR Buffer 2 μl，MgCl2 1.2 μl，dNTP 1.6 μl，上下游引物（10 μmol/L）各1 μl，Taq酶0.1 μl，加ddH2O至20 μl后進行PCR擴增。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，

53 ℃延伸30 s，72 ℃退火2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。PCR產物經回收、連接、大腸桿菌轉化和菌液PCR檢測后，將陽性克隆的菌液送上海生工進行測序。

1.6 序列分析

將測序獲得的序列與GenBank核酸序列數據庫中的序列用blastn程序進行相似性比對；利用Vector NTI 11.5.1軟件選取Clustal W方法對確定的P5CS基因序列與甘蔗ScP5CS基因（EF620362）進行比對；利用DNAMAN軟件和http：//www.bio-soft.net/sms/index.html在線分析軟件預測編碼序列；通過NCBI數據庫對預測氨基酸序列進行保守域檢索。

43卷19期 鐘 浩等 綠竹P5CS基因的擴增及序列分析

2 結果與分析

2.1 綠竹P5CS基因序列克隆

由圖1可知，從綠竹基因組DNA中擴增出2條清晰的條帶，分別為2 kb和1 kb左右。產物經回收、連接、大腸桿菌轉化后，將獲得的陽性克隆送上

海生工進行測序，測序結果分別為2 178和976 bp，經blastn程序相似性比對，確定為P5CS基因序列，命名為DoP5CS1和DoP5CS2。

2.2 綠竹DoP5CS基因片段核苷酸序列分析

通過分析可知，DoP5CS1包含7個內含子，大小分別為465、132、168、156、118、93和70 bp（圖2），其中976 bp為外顯子編碼序列。

將DoP5CS2（圖3）與DoP5CS1的外顯子序列進行同源性分析，大小與外顯子序列一致，只是有4個堿基的差異，相似性達99.6%，缺失了DoP5CS1的內含子（圖4），推測DoP5CS2為返座假基因序列。

將DoP5CS1與甘蔗ScP5CS基因片段（EF620362）進行比對（圖5），結果顯示相似性為78%。

2.3 綠竹DoP5CS基因片段預測的氨基酸序列分析

將DoP5CS1的外顯子與甘蔗ScP5CS基因片段的外顯子（EF620362.1 GI：149900513）進行比對（圖6），相似性為87%，但發現缺失了一個堿基（圖中箭頭所示），這可能是由于PCR擴增或測序時出錯導致的。

鑒于堿基缺失會導致讀碼框位移，在此以977 bp對其氨基酸序列進行預測（圖7），共編碼325個氨基酸殘基，分子量34.787 4 kD，等電點（PI）5.27。

分析其結構特點發現，具有P5CS共有的結構域[11]：Putative leucine domain； Glutamate-5-kinase domain； Putative NADPH-binding domain保守區。

將預測的綠竹DoP5CS1基因氨基酸序列與甘蔗ScP5CS基因氨基酸序列（ABR32187）進行同源性分析（圖8），發現相似性為90%。

將預測的綠竹DoP5CS1基因氨基酸序列在NCBI數據庫進行保守域檢索（圖9），結果顯示其N端有一個氨基酸激酶超家族（Amino Acid Kinases （AAK） superfamily）功能區，C端有一個醛脫氫酶超家族（Aldehyde Dehydrogenase （ALDH） Superfamily）功能區。

3 討論

該研究克隆獲得的DoP5CS1片段包含7個內含子和8個外顯子，而DoP5CS2片段具有大多數返座假基因鮮明特征：完全缺失存在于功能基因中的間隔序列，即內含子序列[13]。因此，推測DoP5CS2片段可能為返座假基因。

在生物的演變進程中，基因序列在復制過程中不斷發生各種變化，包括突變、漂移、插入和缺失等，這些變化有可能導致其失去編碼功能，成為假基因[14]。Makalowski[15]認為這些基因片段與它們鄰近的基因相互作用而影響生物的進化。該研究從綠竹基因組中獲得了P5CS基因的返座假基因片段，說明綠竹與其他植物一樣，在其長期進化過程中由于突變等原因產生一些基因片段，這些基因片段與其功能基因相互作用影響綠竹的遺傳多樣性。

通過氨基酸序列分析發現，獲得的綠竹DoP5CS1基因與其他植物的P5CS基因一樣，均有共同的NADPH的結合位點，這與馬麗清[16]的研究結果一致。

該研究獲得的綠竹DoP5CS1基因片段的結構信息，為該基因全長序列的獲取及其功能研究奠定基礎；也為研究綠竹脯氨酸合成酶系基因及通過分子生物學手段提高綠竹乃至其他竹類植物的抗逆性提供了線索。

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