貓爪草體外抗結核作用研究

楊堃　鄧可眾　李漢興　熊英

摘要 [目的]觀察3種貓爪草的醇提物及貓爪草各不同極性部位對標準結核菌株和耐藥菌株的體外抑菌效果。[方法]采用絕對濃度法，進行3種貓爪草70%乙醇提取物和貓爪草醇提物經萃取分離得到的4個極性不同部位對結核分支桿菌（H37RV）和耐藥菌株的藥物敏感試驗。[結果]3種貓爪草（4 mg/ml）對標準菌株和耐藥菌株均有抑菌作用，且石油醚萃取部位抑菌濃度最低為2 mg/ml。[結論]貓爪草具有明顯的體外抗耐藥結核作用，以石油醚萃取部位抑菌效果最佳。

關鍵詞 貓爪草；H37RV；耐藥結核

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-076-02

近年來由于耐藥及多重耐藥菌株的出現，結核病呈逐漸上升趨勢并對現有的抗結核藥物提出了嚴重挑戰，同時，從化學合成物中尋找有效藥物的難度日益增大，故而從我國豐富的植物資源中尋找有效的抗結核藥物，已引起越來越廣泛的重視。

貓爪草為毛茛科毛茛屬植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根[1]，原為無名野草，是20世紀50年代河南省信陽地區新發現的一種草藥，《中華人民共和國藥典》自1977年版開始，每版均予收載。臨床上主要用于治療頸淋巴結核、肺結核、腮腺炎[2-6]，還可用于治療急慢性咽炎[7]，目前臨床上用于治療結核及耐藥性結核的中成藥有貓爪草膠囊（為單味貓爪草藥材的提取物）以及以貓爪草為主藥的金盾膠囊、療肺散、肺得潤[8-10]等。據文獻報道貓爪草治療結核病具有療效好、無不良反應、遠期療效穩定、不產生耐藥性等獨特優點[8-10]。根據調查發現在江西樟樹藥材市場上市售的貓爪草藥材至少有大小不同的3種類型，為此，筆者采用絕對濃度法對3種貓爪草70%乙醇提取物及其各不同極性部位的體外抗耐藥結核作用進行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗所用的標準菌株為結核分枝桿菌H37RV（由江西省疾控中心提供）；臨床分離耐藥性菌株包括單獨耐異煙肼菌株（耐INH）、雙耐藥性菌株（耐異煙肼和利福平，即耐INH + RFP），由南昌市第三人民醫院臨床病例分離培養；二甲基亞砜（重慶化工試劑廠）、天門冬素（北京三藥科技開發有限公司）、枸櫞酸鎂（成都科龍化工試劑廠）、磷酸二氫鉀（成都科龍化工試劑廠）、硫酸鎂（天津光復精細化工研究所）、甘油（成都科龍化工試劑廠）、孔雀綠（天津光復精細化工研究所），均為分析純；純化水。3種不同的貓爪草藥材于2011年12月購自江西樟樹藥材市場（批號RT1001、1002、1003），經江西中醫藥大學鄧可眾副教授鑒定為R.ternatus Thunb.的干燥塊根。RT1001：本品由8～30個紡錘形的塊根簇生，形似貓爪，長8～20 mm，直徑8～15 mm，頂端有黃褐色殘莖或莖痕。表面黃褐色或灰黃色，微有縱皺紋，并有點狀須根痕和殘留須根。質堅實，斷面類白色或黃白色，空心或實心，粉性。氣微，味微甘。RT1002：本品由7～25個紡錘形的塊根簇生，形似貓爪，長3～10 mm，直徑4～8 mm，其余的同藥材RT1001。RT1003：本品由5～15個紡錘形的塊根簇生，形似貓爪，長3～10 mm，直徑2～8 mm，其余的同藥材RT1001。

1.2 方法

1.2.1 3種貓爪草醇提物抗耐藥結核的研究。

1.2.1.1 樣品的配制。3種貓爪草粉碎，分別稱取50 g，采用70%乙醇8倍量加熱回流提取2次，2次合并，回收乙醇溶液得浸膏備用。

1.2.1.2 結核分枝桿菌培養基的制備。將天門冬素3.6 g、枸櫞酸鎂0.6 g、KH2PO4 2.4 g、MgSO4·7H2O 0.24 g、甘油12 ml、水600 ml、新鮮全雞蛋1 000 ml、2%孔雀綠20 ml等各成分加入600 ml水中，加溫溶解，待冷卻后，加入全雞蛋1 000 ml，再加入2% 孔雀綠20 ml，待用。

1.2.1.3 含藥結核菌培養基的制備。取“1.2.1.1”提取物1 g，加入10 ml DMSO（二甲基亞砜）溶劑溶解，即得濃度為100 mg/ml的原液；然后取原液2 ml，加入“1.2.1.2”制備好的結核培養基48 ml放入試管中，即得濃度為4 mg/ml的含藥培養基；取原液0.5 ml，加入“1.2.1.2”制備好的結核培養基49.5 ml 放入試管中，即得濃度為1 mg/ml的含藥培養基；取原液0.2 ml，加入“1.2.1.2”制備好的結核培養基49.8 ml放入試管中，即得濃度為0.4 mg/ml的含藥培養基；將制備好的含藥培養基放入蒸汽恒溫箱85 ℃，50 min滅菌，同時還制備空白對照組培養基（不含任何藥物的培養基）及陽性對照組培養基（單含異煙肼INH 1 μg/ml及單含利福平RFP 50 μg/ml）。

1.2.1.4 接種。分別挑取已培養H37RV、耐INH、耐INH+RFP菌落各1個，放入研磨管內，研磨成糊狀后，用生理鹽水（無菌）稀釋并用硫酸鋇比濁管比濁成（1 mg/ml）的菌液，再稀釋至10-2 mg/ml，用滅菌吸管準確吸取菌液0.1 ml分別接種于“1.2.1.3”含藥和不含藥培養基的斜面，同時接種于單含INH及單含RFP培養基的斜面作為對照。

1.2.1.5 培養。上述所有的培養基均置于37 ℃培養箱中，培養4周后觀察。

1.2.2 貓爪草4種不同極性部位抗耐藥結核的試驗研究。

1.2.2.1 樣品的配制。取貓爪草（批號RT1001）干燥塊根粉碎，稱取50 g，分別用95%、65%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮至無醇味的總浸膏，將以上得到的總浸膏懸溶解于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3種溶劑分別萃取，將各自萃取所得液減壓濃縮得石油醚部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水層部分浸膏。

1.2.2.2 結核分枝桿菌培養基的制備。同“1.2.1.2”。

1.2.2.3 含藥結核菌培養基的制備。取“1.2.2.1”提取物1 g，加入10 ml DMSO（二甲基亞砜）溶劑溶解，即得濃度為100 mg/ml的原液；然后取原液2.5 ml，加入“1.2.2.2”制備好的結核培養基47.5 ml入試管中，即得濃度為5.0 mg/ml的含藥培養基；取原液1.0 ml，加入“1.2.2.2”制備好的結核培養基49.0 ml放入試管中，即得濃度為2 mg/ml的含藥培養基；取原液0.5 ml，加入“1.2.2.2”制備好的結核培養基49.5 ml放入試管中，即得濃度為1.0 mg/ml的含藥培養基；將制備好的含藥培養基放入蒸汽恒溫箱85 ℃，50 min滅菌，同時還制備空白對照組培養基（不含任何藥物的培養基）及陽性對照組培養基（單含異煙肼INH 1 μg/ml及單含利福平RFP 50 μg/ml）。

1.2.2.4 接種與培養。均同“1.2.1.4”、“1.2.1.5”。

2 結果與分析

2.1 3種貓爪草醇提物抗耐藥結核的試驗研究 由表1可見，市場上3種大小不一的貓爪草醇提物在4.0 mg/ml濃度下對H37RV、耐INH、耐INH+RFP菌株均具有明顯的抑制作用，未見菌落生長；在1.0和0.4 mg/ml低濃度下，抑制作用不明顯。

2.2 貓爪草4種不同極性部位抗耐藥結核的試驗研究 從表2可以看出，同一批貓爪草的4種不同極性部位抗耐藥結核以石油醚萃取物效果最好，其濃度為2 mg/ml時即能明顯抑制H37RV、耐INH、耐INH+RFP的生長。

3 結論

該試驗采用絕對濃度法，對市場上3種大小不一的貓爪草及貓爪草醇提物經萃取分離得到的4個極性不同的萃取部位進行了體外抗耐藥結核作用的研究，結果表明，3種大小不一的貓爪草醇提取物在4 mg/ml濃度下對H37RV、耐INH、耐INH+RFP菌株均具有明顯的抑制作用，未見菌落生長；同一貓爪草的不同極性部位萃取物以石油醚萃取物效果最好，藥物濃度為2 mg/ml時能明顯抑制雙耐藥菌株的生長。該試驗充分證明了中藥貓爪草具有明顯的體外抗結核桿菌和耐藥菌株的作用，下一步的工作擬以抗耐藥結核活性為導向，采用現代色譜技術對貓爪草進一步分離純化，以充分利用和開發這一植物資源。

參考文獻

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