重組Pen—2乳桿菌的抗感染作用及其對小鼠免疫功能的影響

李林曦　倪龍泉　孟小林　王健　徐進平

摘要 [目的]在實驗室成功構建了含有對蝦抗菌肽基因Pen-2的重組乳桿菌L.casei 393/pen的基礎上，研究重組乳桿菌L.casei 393/pen經口服小鼠后的抗感染和免疫促進作用。[方法]將昆明系小鼠和balb/c系小鼠隨機分為生理鹽水組、乳桿菌L.casei 393組和重組乳桿菌L.casei 393/pen組，口服灌胃小鼠。每隔7 d測量小鼠體重，28 d后檢測小鼠的免疫器官指數和細胞因子IL-6的濃度，并用金黃色葡萄球菌對其進行腹腔注射攻毒。[結果]灌胃28 d后，重組乳桿菌L.casei 393/pen組的體重、免疫器官指數和細胞因子IL-6濃度均明顯高于其他2個試驗組；用金黃色葡萄球菌攻毒后，重組乳桿菌L.casei 393/pen組的死亡率比乳桿菌L.casei 393低50%，比生理鹽水組低83.3%。[結論]重組乳桿菌L.casei 393/pen經口服小鼠后，具有顯著的抗金黃色葡萄球菌感染和較好的免疫促進作用。

關鍵詞 干酪乳桿菌；對蝦抗菌肽Pen-2；表達載體；免疫促進

中圖分類號 S865.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-118-04

抗菌肽是指一類具有抗菌活性的小分子多肽。它廣泛存在于自然界中，在宿主的先天性免疫中有著重要的作用[1-3]。其中，對蝦抗菌肽Penaeidins是來源于南美白對蝦（Penaeus vannamei）的一類抗菌肽[4]，由Delphine Destoumieux 等于1997年在南美白對蝦的血淋巴中分離到。Penaeidins的分子量大小為5.48～6.62，與大多數抗菌肽類似，富含陽離子，等電點為9.34～9.84[5]。它具有2個富含脯氨酸或半胱氨酸的區域，C端有3個分子內二硫鍵，并且需要進行翻譯后修飾[6]。其中，Pen-2是Penaeidins家族中的一員，成熟的Pen-2分子的C端是以酰胺化的形式存在的。研究表明，Penaeidins家族抗菌肽具有廣譜抗菌活性，并且還具有與幾丁質相連的特性，因此它能抵抗細菌和真菌，尤其是革蘭氏陽性菌[7-8]。人們通過不同的表達系統來重組表達Penaeidins，其中常用的表達系統有大腸桿菌[9]和酵母[10-11]，但鮮少有用乳酸菌作為重組表達系統的。筆者以乳酸菌為表達載體，進行Pen-2的活性探究。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類以糖類為碳源，發酵產物為乳酸的無芽孢G+菌。筆者選用的表達宿主干酪乳桿菌（L.casei）是乳酸菌中的一種，它在1971年被Hansen和Lessel選出來作為干酪乳桿菌的新模式菌株[12]，被公認為“三大益生菌”之一。它作為食品級微生物，具有大規模發酵研究前景，與人類的生活密切相關，被廣泛應用于食品工業、醫療保健、農業等各業[13]。干酪乳桿菌也是人類腸道和口腔內的正常菌群，能抵抗胃酸、膽汁、具有低免疫原性，并且能夠定植于腸道，是作為口服疫苗的理想載體[14-17]。該研究中所用的干酪乳桿菌質粒為實驗室構建表達載體，能有效地將外源基因重組進干酪乳桿菌中進行表達，并將其錨定于細胞壁表面。因此，用干酪乳桿菌作為宿主表達對蝦抗菌肽Pen-2，可使Pen-2通過口服的方式進入免疫宿主體內，并且與干酪乳桿菌的腸道黏膜定植功能相結合，從而更好地研究Pen-2的免疫促進作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級別6周齡的Balb/c小鼠和6周齡的昆明小鼠，雌性，體重為（18±2）g；鼠糧，購自湖北省疾控中心的實驗動物研究中心。

1.2 菌種 重組乳桿菌L.casei 393/pen由病毒學國家重點實驗室構建；乳桿菌L.casei 393，于實驗室-70 ℃超低溫冰箱中保存；金黃色葡萄球菌，購自中國典型培養物保藏中心。

1.3 試劑 苦味酸（用于給小鼠進行標記，購自武漢眾一生物有限公司）；LB培養基；MRS培養基和MRS誘導培養基（pH 6.2～6.5）；濃度為0.9%的無菌生理鹽水；小鼠細胞因子IL-6的ELISA檢測試劑盒（48孔，購自武漢百騰生物有限公司）；PBS（pH 8.0）；75%酒精。

1.4 儀器 臥式冷凍離心機，為美國sigma公司產品；灌胃針頭，為武漢眾一生物有限公司產品；1 ml無菌注射器和分析天平，為上海越平科學儀器有限公司產品；電熱恒溫培養箱，為上海浦東躍欣儀器廠產品；恒溫搖床，為中國科學院武漢科學儀器廠產品；常溫離心機，為德國Eppendorf公司產品；超凈工作臺；小鼠解刨實驗器具。

1.5 方法

1.5.1 試驗分組和給藥途徑。將小鼠分為口服生理鹽水對照組、乳桿菌L.casei 393組和重組乳桿菌L.casei 393/pen組。通過灌胃的方式進行口服給藥，生理鹽水對照組灌胃生理鹽水，劑量為0.5 ml/只；乳桿菌L.casei 393組灌胃菌濃度為109 CFU/ml的乳桿菌L.casei 393生理鹽水懸濁液，劑量為0.5 ml/只；重組乳桿菌L.casei 393/pen組灌胃菌濃度為109 CFU/ml的重組乳桿菌L.casei 393/pen生理鹽水懸濁液，劑量為0.5 ml/只。

1.5.2 乳桿菌L.casei 393和重組乳桿菌L.casei 393/pen的培養及處理。在MRS基本培養基內，分別轉接300 μl乳桿菌L.casei 393和重組乳桿菌L.casei 393/pen，置于37 ℃恒溫培養箱內，靜置培養48 h；在MRS誘導培養基內，轉接300 μl基本培養2 d的菌液，于37 ℃恒溫培養箱中靜置培養72 h；誘導培養好的菌液，在冰上處理集菌，使用冷凍離心機8 000 r/min離心5 min，棄上清培養基，稱菌濕重，根據實驗室經驗值計算出菌體個數。用預冷的pH 8.0的PBS洗菌3次，冷凍離心機8 000 r/min 5 min，最后用0.9%的生理鹽水重懸，調整菌濃為1010 CFU/ml。

1.5.3 對金黃色葡萄球菌腹腔注射小鼠的保護作用。

1.5.3.1 金黃色葡萄球菌對小鼠最小致死劑量的測定。接種金黃色葡萄球菌甘油菌接種于新鮮的20 ml LB培養基， 37 ℃搖床，12 h過夜，用10倍稀釋法將菌液進行稀釋，分別稀釋10-5倍、10-6倍、10-7倍，分別取各濃度的100 μl菌液涂布于LB固體培養基，37 ℃恒溫箱靜置培養過夜。通過平板菌落計數，確定原先LB液體培養基12 h培養過夜的菌濃。選取9只小鼠，分為3組，依次按照金黃色葡萄球菌的濃度為1.2×108、1.2×109和1.2×1010 CFU/ml，進行腹腔注射攻毒，使用1 ml注射器，每只小鼠注射0.5 ml，觀察48 h內死亡率。

1.5.3.2 口服灌胃pDL-Pen/L.C 393工程菌對金黃色葡萄球菌腹腔注射小鼠的保護作用。對灌胃28 d的各組小鼠，在第29天腹腔注射最小致死劑量濃度的金黃色葡萄球菌：大批量培養金黃色葡萄球菌，37 ℃過夜培養12 h，離心集菌后用LB培養基重懸，調整濃度為最小致死劑量（1.2×1010）；用腹腔注射法對3個試驗組小鼠進行攻毒，注射完畢后觀察無菌液有沒有外漏和注射是否成功；常規喂鼠糧和水，觀察小鼠的死亡情況。

1.5.4 對小鼠生理指標的影響。每隔2 d對3組試驗小鼠灌胃生理鹽水、乳桿菌L.C 393和重組乳桿菌L.casei 393/pen，每次在上午9：00進行灌胃口服，每隔7 d測量體重，分別在第0、7、14、21、28天，空腹6 h后測量體重。

1.5.5 對小鼠外周血細胞因子IL-6的影響。用小鼠細胞因子IL-6 ELISA檢測試劑盒，對小鼠外周血細胞因子IL-6進行檢測。用摘除眼球法取血，滅菌EP管收集血液，37 ℃水浴30 min，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清分裝到滅菌的150 μl EP管內；將板條從4 ℃取出后，在室溫下平衡20 min；設置標準孔和樣本孔，直接用血清作為樣品，并用記號筆進行標記；按照說明書步驟進行操作，反應的最后在每孔加入終止反應液50 μl，使用酶標儀在450 nm處測定各孔的OD值。

1.5.6 對小鼠免疫器官的影響。連續灌胃28 d后，用頸椎脫臼法處死小鼠，造成勁椎脫臼，小鼠立即死亡。 小鼠死亡后對其進行解剖，用消毒的鑷子和手術剪取出位于小鼠左腹部的脾臟和位于心臟的正上方的胸腺。小心剝離胸腺、脾臟和周圍組織，用吸水紙吸干脾臟和胸腺的表面水分，置于天平上稱重。根據以下公式

計算脾臟指數和胸腺指數：臟器系數=器官重量/小鼠體重。

2 結果與分析

2.1 對金黃色葡萄球菌腹腔注射小鼠的保護作用

2.1.1 最小致死劑量。分別用濃度為108、109、1010 CFU/ml的金黃色葡萄球菌腹腔注射小鼠，結果表明48 h內1010 CFU/ml組小鼠全部死亡，而108 CFU/ml組和109 CFU/ml組的小鼠依舊存活。因此，選取1010 CFU/ml為金黃色葡萄球菌的最小致死劑量。

2.1.2 死亡率。生理鹽水組、乳桿菌L.case組、重組乳桿菌L.casei 393/pen組，分別取9只小鼠，在連續口服灌胃的28 d后，第29天用濃度為1010 CFU/ml金黃色葡萄球菌腹腔注射經口服灌胃的3組實驗小鼠。從圖1可以看出，生理鹽水組、乳桿菌L.casei 393組和重組乳桿菌L.casei 393/pen組試驗小鼠的死亡率分別為100%、66.7%和16.7%。重組乳桿菌L.casei 393/pen組死亡率比乳桿菌L.C 393組降低了50%，比生理鹽水組降低了83.3%。

2.2 對小鼠生理指標體重的影響

體重作為生理指標之一，能在一定程度上反映機體的身體素質，在28 d內，每隔2 d口服灌胃小鼠，分別在第0、7、14、21、28天空腹6 h后，稱量小鼠體重。從圖2可以看出，3組小鼠的體重有顯著差異（P<0.05），說明在干酪乳桿菌的對機體益生作用的基礎上，重組乳桿菌L.casei 393/pen所表達的Pen-2對小鼠體重也有一定的促進作用。

2.3 對小鼠外周血細胞因子IL-6的影響

2.3.1 細胞因子IL-6的標準曲線。以不同的濃度的標準品為對象，計算出不同的IL-6濃度與OD450之間的對應關系，繪制出標準曲線（圖3）。

2.3.2 各組小鼠細胞因子IL-6濃度。分別取口服灌胃28 d后的3組小鼠的血清，與小鼠細胞因子IL-6的ELISA檢測板進行孵育，最后檢測450 nm處的吸光值OD450 nm，將吸光值代入圖2中計算出每組小鼠細胞因子IL-6的濃度。從圖4可以看出，重組乳桿菌L.casei 393/pen組的細胞因子IL-6的濃度明顯高于乳桿菌L.casei 393組和生理鹽水組（P<0.05）。

2.4 對小鼠免疫器官的影響 解剖3組口服灌胃的試驗小鼠，取出胸腺和脾臟器官，用吸水紙吸干稱量，計算出免疫器官指數。從圖5～6可以看出，重組乳桿菌L.casei 393/pen組的胸腺指數和脾臟指數均明顯高于乳桿菌L.casei 393組和生理鹽水空白對照組（P<0.05）。

3 討論

由于在當今的醫療中，人們對抗生素濫用的情況越來越嚴重，導致了很多超級細菌的產生，因此尋找新的抗菌藥物已成了人們關注的焦點。與此同時，抗菌肽——一種具有抗菌效果并且廣泛存在與自然界中的小分子多肽進入了人們的研究范圍。抗菌肽的抗菌機理不同于抗生素，是通過在細胞膜形成離子通道，使得細菌細胞不能保持正常的滲透壓而死亡，因此它不容易使病原微生物產生抗藥性。另外，抗菌肽廣泛存在與自然界的各種生物中，屬于內源性的抗生素。該研究對象Pen-2抗菌肽是首次從南美白對蝦血淋巴中分離得到的1種甲殼類抗菌肽家族中的一員。大多數的抗菌肽具有廣譜抗菌活性，不同來源的抗菌肽抗菌范圍有所不同。Pen-2抗菌肽也具有光譜抗菌活性，主要針對絲狀真菌和革蘭氏陽性菌。在這些年的研究中，人們發現除了抗菌活性，某些抗菌肽還具有一定的免疫調節活性：能作為免疫效應細胞的趨化因子；能調節炎癥反應、促進細胞因子的表達；能促進B淋巴細胞和T淋巴細胞的增值等等。筆者以甲殼類抗菌肽Pen-2的重組乳桿菌為研究對象，探究小鼠口服攝入后的免疫調節功能。

乳酸菌作為益生菌中的主要成員，基于其為人所熟知的益生作用，被廣泛應用于人們的生活中。乳酸菌作為外源基因表達系統，有以下優點：本底表達量低，易于外源蛋白表達后純化；基因工程菌的構建方法逐漸成熟，易培養；根據表達載體的不同，不僅可以胞內表達、分泌表達，而且可以將外源蛋白展示于菌體表面；其誘導表達系統所用誘導物也均為食品級，可應用于大規模的食品發酵工業中；安全性高，無內毒素，可直接口服攝入體內，大大降低了表達產物后的處理成本。其中，乳酸菌的可直接口服性是它相對其他表達系統的巨大優勢，口服攝入可以方便大范圍攝入，避免了靜脈注射而導致感染的危險，并且口服免疫產生的抗體大部分都分泌到消化系統，使得很多致病微生物不能通過宿主機體的的黏膜表面進入身體組織。干酪乳桿菌也是乳酸菌中的一種，是公認的三大益生菌之一，廣泛應用于食品發酵工業中。筆者以干酪乳桿菌作為表達宿主，不僅可以直接口服給藥大大簡化Pen-2的表達后純化工作，而且干酪乳桿菌能夠耐受機體的防御機制（如胃酸、膽汁等），并長期定植于腸道內，持續穩定地表達Pen-2基因，這能使我們更好地研究Pen-2的長期作用效果。

筆者對小鼠進行口服灌胃重組乳桿菌L.casei 393/pen組，并設置乳桿菌L.C 393對照組和生理鹽水空白對照組，從生理指標、免疫器官指數、細胞因子的促進作用及其對金葡菌攻毒的保護作用等方面研究了重組乳桿菌L.casei 393/pen對小鼠的免疫調節功能的影響。在口服灌胃28 d后，對比生理鹽水對照組，重組乳桿菌L.casei 393/pen能明顯促進小鼠的體重增長、脾臟細胞和胸腺細胞的增值以及促進細胞因子IL-6的分泌（P<0.05）。此外，乳桿菌L.casei 393相對于生理鹽水組也有一定的差異，這可能是因為干酪乳桿菌是三大益生菌之一，對機體的免疫功能也有一定的促進作用。在金葡菌的攻毒試驗中，生理鹽水組的小鼠全部在24 h內死亡，乳桿菌L.casei 393的小鼠有66.7%在48 h內陸續死亡，另有33.3%的小鼠存活下來，而重組乳桿菌L.casei 393/pen，只有16.7%的小鼠死亡，并且是在48～72 h內死亡的，其余83.3%的小鼠均存活下來。雖然重組乳桿菌L.casei 393/pen也有一定的死亡率，但是從死亡時間上來看重組乳桿菌L.casei 393/pen也可以起到攻毒后延緩死亡的作用。雖然乳桿菌L.casei 393組還有33.3%存活，但遠不如重組乳桿菌L.casei 393/pen組小鼠的存活率，說明雖然干酪乳桿菌有一定的益生作用，但重組乳桿菌L.casei 393/pen較乳桿菌L.casei 393有更為明顯的保護作用。

雖然該試驗結果還不足以完全證實，還需后續實驗進行完善，但是從生理指標、免疫器官指數、細胞因子的促進作用以及對金葡菌攻毒的保護作用等方面可以看出，小鼠口服重組乳桿菌L.casei 393/pen后其對小鼠的免疫功能是具有一定的增強作用。該試驗結果對口服抗菌肽基因工程乳酸菌藥物的研制有一定的參考價值。

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