圭亞那柱花草新EST—SSR標記驗證及其在柱花草屬上的轉移

丁西朋 羅小燕 賈慶麟 白昌軍

摘 ?要 ?柱花草（Stylosanthes spp.）是我國南方熱帶地區優良豆科牧草。為獲得高效的柱花草分子標記，本課題組利用熱研5號圭亞那柱花草（Stylosanthes guianensis）轉錄組測序數據開發了2008個EST-SSR標記。為驗證新EST-SSR標記的有效性及在柱花草屬中的通用性，本研究從中隨機挑選117個EST-SSR標記并分析了其在圭亞那柱花草中的有效性及其在其他8種柱花草中的可轉移性。結果表明，有98個EST-SSR標記可獲得有效擴增，其中96個在不同柱花草種質間有多態性，每個標記檢測出的等位基因2～11個，共檢測到等位基因456個。98個EST-SSR標記在其他8種柱花草間的可轉移率為82.2%～100%，其中69個標記在8種柱花草間都能有效擴增。

關鍵詞 ?柱花草;EST-SSR;標記開發;遺傳多樣性分析

中圖分類號 ?S541 ? ? ? ? ?文獻標識碼 ?A

Transferability of Novel EST-SSR Markers in Stylosanthes

guianensis Across the Species of Stylosanthes

DING Xipeng， LUO Xiaoyan， JIA Qinglin， BAI Changjun*

Institute of Tropical Crops Genetic Resources， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract ?To obtain effective molecular markers for Stylosanthes which is one of the most excellent legume forages， 2008 EST-SSR markers were developed using the transcriptomic sequences from S. guianensis cv. Reyan No.5. To assess the usefulness and universality of these novel EST-SSR markers within Stylosanthes genus， 117 EST-SSR markers were selected to determine the usefulness in S. guianensis and the transferability among other close eight species. The results showed that 98 of 117 EST-SSR markers were able to produce reliable bands with expected sizes and 96 markers were polymorphic， with 2～11 alleles among different Stylosanthes accessions. The transferability of 98 validated EST-SSR markers across other close eight species was very high， ranging from 82.2% to 100%， and 69 markers of them were common in all eight species of Stylosanthes. The results would provide a basis for the application of EST-SSR in genetic diversity， construction of genetic maps， and molecular marker-assisted selection breeding in stylo species.

Key words ?Stylosanthes spp.; EST-SSR; Marker-development; Genetic diversity

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.006

分子標記是作物遺傳學研究和分子標記輔助育種的重要工具，SSR標記具有數量豐富、多態性高、共顯性、操作簡單等多個優點，在水稻、擬南芥、玉米等多種植物中被開發并應用于遺傳多樣性分析、指紋圖譜構建、遺傳連鎖圖譜構建和分子標記輔助育種等方面[1-2]。根據來源不同，SSR標記可分為基因組SSR（genomic-SSR）和 EST-SSR兩種[3]。EST-SSR標記是基于EST 序列開發的SSR標記，與傳統的genomic-SSR標記開發相比較，不僅開發速度快，且成本低。由于EST-SSR來源于表達的基因組區域，其多態性可能與基因功能直接相關，從而強化了EST-SSR標記在遺傳學領域研究中的應用[4]。此外，由于EST序列比基因組DNA序列相對保守，所以EST-SSR標記相對于genomic-SSR標記在不同種間的通用性更高，但多態性較低[5]。近年來，隨著EST序列的迅速發展，基于EST的SSR標記開發也在日趨增加。目前，EST-SSR標記已在苜蓿[6-7]、羊草[8]、木豆[9]、黑麥草[10]等牧草中得到開發和應用。

柱花草（Stylosanthes spp.）又名筆花豆，為多年生豆科植物，原產于拉丁美洲。因其適應性強、耐貧瘠、抗旱、飼草產量高、營養價值高，兼具改良土壤、水土保持的功效，是全球熱帶及亞熱帶地區廣泛種植的優良豆科牧草之一[11]。柱花草屬包含約50個種，常用的栽培品種主要來自圭亞那柱花草（Styosanthes guianensis）、有鉤柱花草（S. hamata）、糙柱花草（S. scabra）和頭狀柱花草（S. macrocephala）等。1957年，我國開始柱花草的引種選育與栽培研究，先后選育出維拉諾有鉤柱花草（S. hamata ‘Verano）、熱研5號圭亞那柱花草（S. guianensis ‘Reyan No. 5）、西卡糙柱花草（S. scabra‘Seca）等12個柱花草優良品種[12]。目前，國內外柱花草遺傳學研究的報道以RAPD、AFLP和ISSR等分子標記為主，柱花草SSR標記開發及驗證的相關報道非常有限，極大地限制了該標記在柱花草遺傳學研究領域中的應用[13]。本課題組已利用熱研5號圭亞那柱花草轉錄組測序數據開發了EST-SSR標記2008個，本研究從中隨機挑選117個EST-SSR標記，驗證了新開發的EST-SSR標記的有效性和實用性，并分析了其在不同柱花草種間的可轉移性，為利用EST-SSR 標記開展柱花草遺傳學研究提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試材料 ? 來自9個不同柱花草種的12份柱花草種質（表1），包括4份圭亞那柱花草種質和8份其他不同種的柱花草種質，均由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心收集。

1.1.2 ?試劑 ? 挑選的117對EST-SSR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成（表2），試驗中Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×PCR Buffer（含Mg2+）及DL 2 000均購自TaKaRa公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?材料種植及取樣 ? 將去皮的柱花草種子置于80 ℃水中浸泡5 min，然后在25 ℃恒溫條件下的人工智能氣候箱中進行發芽，發芽后移植至14 L塑料盆中進行營養液培養。培養1個月后，每份種質隨機挑選5株，對葉片進行混合取樣，置于液氮保存，用于DNA抽提。

1.2.2 ?基因組總DNA抽提 ? 利用改良的CTAB法從柱花草葉片中提取基因組總DNA[14]，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，然后用NanoVue超微量分光光度計（GE Healthcare）測定其濃度，將DNA濃度稀釋至100 ng/μL后置于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3 ?PCR擴增及產物檢測 ? PCR擴增反應體系為20 μL，包括2.0 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），1.0 μL模板DNA（100 ng/μL），0.4 μL正向引物 （10 μmol/L），0.4 μL反向引物（10 μmol/L），1.2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.3 μL Taq DNA 聚合酶（5 U/μL），剩余體積用ddH2O補足。PCR反應擴增程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環35次;最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物用8% PAGE（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯酰胺凝膠電泳）電泳后，采用硝酸銀法染色，最后照相記錄[14]。

1.3 ?數據分析

擴增產物片段大小以DL 2 000 DNA marker作為分子量參考來讀取，對大小合適、清晰且易于辨認的譜帶采用“0，1”系統記錄其位置，無條帶記為“0”，有條帶記為“1”。所記錄的原始數據匯總到Excel表格中并形成數據矩陣，用于擴增條帶的多態性比較和聚類分析。利用NTSYS-pc 2.10e軟件分析柱花草種質間的遺傳相似系數（Genetic Similarity， GS），然后利用GS值采用非加權組平均法（Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means， UPGMA）對供試材料進行聚類分析[15]。利用POPGENE 1.32軟件計算每個位點的遺傳多樣性參數，包括等位基因數、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）和Shannon指數[16]。每個位點的多態性信息含量（Polymorphic Information Content， PIC）按公式PIC=1-∑k Pi2進行計算，k表示每個位點檢測到的等位基因數目，Pi表示第i個等位基因在供試材料中出現的頻率[17]。

2 ?結果與分析

2.1 ?柱花草新EST-SSR標記的有效性

在轉錄測序數據拼接過程中存在的誤差、EST對應DNA 序列存在的內含子或引物存在的非特異性結合位點等原因，都會引起其對應EST-SSR標記無效。本研究結果表明：在117對EST-SSR引物中，98對在4份圭亞那柱花草種質中均可獲得大小合適、條帶清晰的譜帶，確定為有效引物，占總引物的83.76%。剩下的19對中有9對擴增產物偏大、5對（RM15、RM44、RM66、RM164和RM170）沒有產物、5對（RM13、RM20、RM72、RM124和RM148）有多條帶（表2）。

2.2 ?圭亞那柱花草新EST-SSR標記在8種柱花草間的可轉移性

不同的EST-SSR標記在柱花草種間的轉移率不同。在98個有效引物檢測到的101個SSR位點中，有31個位點至少在1個柱花草種中無擴增產物（表3），其中有10個SSR位點只在1種柱花草中檢測不到，可轉移率為87.5%;有10個SSR位點在2種柱花草中不能被檢測到，可轉移率為75.0%;有4個SSR位點在3種柱花草中檢測不到，可轉移率為62.5%;有2個SSR位點（RM132和RM153）在4種柱花草中檢測不到，可轉移率為50.0%;有4個SSR位點在6種柱花草中不能被檢測到，可轉移率為25.0%;只有1個SSR點（RM74-1）在7種柱花草中不能被檢測到，可轉移率為12.5%。剩下的70個位點（占總位點數的69.31%）在供試的其他8個柱花草種中都可以檢測到（表3），說明大部分新EST-SSR標記在不同柱花草種中具有較高的通用性。

98個有效EST-SSR引物在8種不同柱花草種間的可轉移性存在較大的差異，可轉移率為82.2%～100%（表3）。其中，在大頭柱花草（S. macrocephala）中可檢測到有效位點83個，可轉移率為82.2%，在粘質柱花草（S. viscosa）和狹葉柱花草（S. angustifolia）中均可檢測到有效位點84個，可轉移率為83.2%。相比而言，在有鉤柱花草（S. hamata）和糙柱花草（S. scabra）中有92個有效位點可被檢測到，可轉移率達到91.1%，在矮柱花草（S. humilis）和細莖柱花草（S. gracilis）中有94個有效位點可被檢測到，可轉移率達到93.1%，而在馬弓形柱花草（S. hippocampoides）有效引物的可轉移率達到了100%。由此可見，不同柱花草種的遺傳背景存在明顯差異，因而檢測得到EST-SSR位點的數量和位置也表現出差別，說明篩選獲得的可轉移性EST-SSR引物可以對不同柱花草種進行有效區分。

2.3 ?EST-SSR標記特征分析

在98對有效引物中共檢測到SSR位點101個，其中RM74、RM76和RM138均擴增出2個SSR位點（表2）。在101個檢測到的SSR位點中，只有2個位點（RM106和RM120）在12份柱花草種質中沒有多態性，其他99個位點均有多態性，共檢測到456個等位基因，平均每個位點4.61個等位基因（表2）。其中6個位點有2個等位基因，21個位點有3個等位基因，20個位點有4個等位基因，29個位點有5個等位基因，13個位點有6個等位基因，7個位點有7個等位基因，RM75、RM146和RM163分別有8、10和11個等位基因（圖1）。

利用POPGENE 1.32軟件分析每個位點的遺傳多樣性參數，結果顯示，99個多態性位點的觀察雜合度（Ho）的變化范圍為0.000～0.400，平均值為0.083，而期望雜合度（He）的變化范圍為0.159～0.928，平均值為0.658（表4）。各多態性位點的PIC值變化范圍為0.153～0.889，平均為0.629，其中PIC<0.25的只有2個分子標記（RM74-2和RM172），而PIC>0.5的有78個位點，占總多態性位點的78.79%。位點RM74-2的PIC值最低為0.153，RM146的PIC值最高為0.889（表4）。各多態性位點的Shannon指數變異范圍為0.287～2.268，其平均值為1.228，同樣表明了新開發EST-SSR標記較好的多態性。

2.4 ?遺傳多樣性分析

利用NTSYS-pc 2.10e分析軟件，根據98個有效引物的數據分析12份柱花草種質的遺傳多樣性，結果表明，所有供試材料間的遺傳相似系數GS變化范圍為0.57～0.87，平均為0.69，說明這12份柱花草種質間的遺傳多樣性比較豐富。其中，圭亞那柱花草熱研5號與圭亞那柱花草GC1581的遺傳相似性最大，GS值為0.87，這可能是因為它們來自圭亞那柱花草種中相同的亞種（圭亞那亞種）;其次，糙柱花草CIAT66和粘質柱花草CIAT1011的遺傳相似性也較大，GS值為0.80，可能是由于粘質柱花草是糙柱花草祖先之一的原因[18];而圭亞那柱花草GC1581和糙柱花草CIAT66的遺傳相似性最小，GS值為0.57。

基于多態性SSR引物的UPGMA聚類分析結果表明，12份來自不同種的柱花草種質可以明顯地被分為2大類（圖2）。熱研5號柱花草、GC1581柱花草、CIAT1283柱花草、CIAT10121柱花草、Fine stem柱花草和CIAT1361柱花草被歸為一類，其中前4份種質都屬于圭亞那柱花草，Fine stem柱花草屬于馬弓形柱花草，CIAT1361柱花草屬于細莖柱花草，雖然它們屬于不同的種，但是它們具有相同類型的基因組（G類）[17]。剩下的矮柱花草CIAT58、狹葉柱花草CIAT1291、有鉤柱花草CIAT58、糙柱花草CIAT66、粘質柱花草CIAT1011和大頭柱花草CIAT1643被歸為一類。其中有鉤柱花草CIAT58、糙柱花草CIAT66和粘質柱花草CIAT1011雖然屬于不同的種，倍性也不相同，但擁有相同類型的基因組（有鉤柱花草A類，糙柱花草AB類，粘質柱花草A類）[18]，所以它們的親緣關系比較近。

3 ?討論與結論

本研究檢測的117對EST-SSR引物中，98對可獲得大小合適、條帶清晰的譜帶，有效引物比例（83.76%）和甘薯中EST-SSR引物的有效引物比例（84.6%）相近[19]，高于木豆（71.24%）[9]、苜蓿（62.96%）[7]和茶葉（59.9%）[20]，但低于苧麻（98.0%）[21]。引物沒有擴增產物可能是因為EST-SSR位點對應的DNA序列中存在較大內含子或不同剪切方式造成的，擴增產物偏大可能是由于EST-SSR位點對應的DNA序列中存在內含子造成的，而擴增條帶偏多可能是因為引物非特異性結合引起的。

不同SSR引物對應序列的保守性不一樣，所以不同SSR引物在柱花草種間的可轉移性不同。本研究98對有效引物共檢測到101個SSR位點，在8種柱花草間的可轉移率為12.5%～100%，平均可轉移率為89.36%。Chandra等[12]開發的21個genomic-SSR標記在柱花草種間的可轉移率為0～100%，平均僅為45.24%，而20個EST-SSR標記在柱花草種間的可轉移率為40%～100%，平均為82.0%。由于不同柱花草種遺傳背景的差異，SSR引物在不同柱花草種間的可轉移性存在較大差異。本研究有效EST-SSR標記在8種不同柱花草中的可轉移率為82.2%～100%，平均為89.63%。Santos等[22]開發的genomic-SSR標記在3種柱花草間的可轉移率為35%～50%，平均為40.0%。Chandra等[12]開發的genomic-SSR標記在4種柱花草間的可轉移率為38.1%～61.9%，平均為45.25%，而EST-SSR標記在5種柱花草間的可轉移率為78.9%～94.7%，平均為85.72%。無論是單個標記還是在不同種間，EST-SSR標記的可轉移率都明顯大于genomic-SSR。

據Bostein等[23]提出的衡量分子標記多態性標準，當PIC>0.5時，該分子標記為高多態性標記，當0.5>PIC>0.25時，該分子標記為中多態性標記，當PIC<0.25時，該分子標記為低多態性標記。本研究結果顯示99個多態性位點中，PIC>0.5的有78個位點，占總多態性位點的78.79%，表明新開發的EST-SSR標記具有很好的多態性和應用價值。

聚類分析可將12份柱花草種質分為2大類（圖2），這與利用STS標記[24-25]，RFLP標記[25-26]和ITS標記[27]對柱花草種間親緣關系的研究結果相一致。在Ⅰ類中，3種柱花草的基因組都屬于G類。馬弓形柱花草和細莖柱花草原本都被視為圭亞那柱花草的一個亞種[18]，Calles和Schultze-Kraft[28]將細莖柱花草重新定義為一個種，而馬弓形柱花草至今無定論。在Ⅱ類中，雖然有鉤柱花草CIAT58、糙柱花草CIAT66和粘質柱花草CIAT1011屬于不同的種，但它們擁有相同類型的基因組（A類），所以親緣關系比較近[18]。

參考文獻

[1] Zane L， Bargelloni L， Patarnello T. Strategies for microsatellite isolation： a review[J]. Molecular Ecology， 2002， 11（1）： 1-16.

[2] Kalia R K， Mai M K， Kalia S， et al. Microsatellite markers： an overview of the recent progress in plants[J]. Euphytica， 2011， 177（3）： 309-334.

[3] Tan C， Wu Y， Taliaferro C M， et al. Development of simple sequence repeat markers for bermudagrass from its expressed sequence tag sequences and preexisting sorghum SSR markers[J]. Molecular Breeding， 2012， 29（1）： 23-30.

[4] Varshney R K， Graner A， Sorrells M E. Genic microsatellite markers in plants： features and applications[J]. Trends in Biotechnology， 2005， 23（1）： 48-55.

[5] Ellis J R， Burke J M. EST-SSRs as a resource for population genetic analyses[J]. Heredity， 2007， 99： 125-132.

[6] Liu Z， Chen T， Ma L， et al. Global transcriptome sequencing using the Illumina platform and the development of EST-SSR markers in autotetraploid alfalfa[J]. PLoS One， 2013， 8（12）： e83549.

[7] Wang Z， Yu G， Shi B， et al. Development and characterization of simple sequence repeat（SSR）markers based on RNA-sequencing of Medicago sativa and in silico mapping onto the M. truncatula genome[J]. PLoS One， 2014， 9（3）： e92 029.

[8] Chen S， Huang X， Yan X， et al. Transcriptome analysis in sheepgrass（Leymus chinensis）： a dominant perennial grass of the Eurasian Steppe[J]. PLoS One， 2013， 8（7）： e67974.

[9] Dutta S， Kumawat G， Singh B P， et al. Development of genic-SSR markers by deep transcriptome sequencing in pigeonpea[Cajanus cajan（L.）Millspaugh][J]. BMC Plant Biology， 2011， 11： 17.

[10] Studer B， Asp T， Frei U， et al. Expressed sequence tag-derived microsatellite markers of perennial ryegrass（Lolium perenne L.）[J]. Molecular Breeding， 2008， 21（4）： 533-548.

[11] 蔣昌順.柱花草的研究進展[J]. 熱帶作物學報， 2005， 26（4）： 104-108.

[12] 白昌軍， 劉國道， 陳志權， 等. 熱研20號太空柱花草選育研究報告[J]. 熱帶作物學報， 2011， 32（1）： 33-41.

[13] Chandra A， Tiwari K K， Nagaich D， et al. Development and characterization of microsatellite markers from tropical forage Stylosanthes species and analysis of genetic variability and cross-species transferability[J]. Genome， 2011， 54（12）： 1 016-1 028.

[14] 張 ?龍， 丁西朋， 嚴琳玲， 等. 8種柱花草屬牧草SSR-PCR反應體系優化及引物篩選[J]. 草業科學， 2014， 31（2）： 233-242.

[15] Rohlf F J. NTSYS-pc Numerical taxonomy and multivariate analysis system， version 2.10[M]. New York： Exeter Software， 2000.

[16] Yeh F C， Yang R C， Boyle T. POPGENE， version 1.32： the user friendly software for population genetic analysis[M]. Molecular Biology and Biotechnology Centre， University of Alberta， Edmonton， AB， Canada， 1999.

[17] Varshney R K， Grosse I， Hahnel U， et al. Genetic mapping and BAC assignment of EST-derived SSR markers shows non-uniform distribution of genes in the barley genome[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2006， 113（2）： 239-250.

[18] Maass B L， Sawkins M. History， relationships and diversity among Stylosanthes species of commercial significance[M] // Chakraborty S ed. High-yielding anthracnose-resistant Stylosanthes for agricultural systems. Australia： Australian Centre for International Agricultural Research（ACIAR）， 2004： 9-26.

[19] Wang Z， Li J， Luo Z， et al. Characterization and development of EST-derived SSR markers in cultivated sweetpotato（Ipomoea batatas）[J]. BMC Plant Biology， 2011， 11： 139.

[20] Tan L Q， Wang L Y， Wei K， et al. Floral transcriptome sequencing for SSR marker development and linkage map construction in the tea plant（Camellia sinensis）[J]. PLoS One， 2013， 8（11）： e81 611.

[21] Liu T， Zhu S， Fu L， et al. Development and characterization of 1， 827 expressed sequence tag-derived simple sequence repeat markers for ramie（Boehmeria nivea L. Gaud）[J]. PLoS One， 2013， 8（4）： e60 346.

[22] Santos M O， Karia C T， Resende R M， et al. Isolation and characterization of microsatellite loci in the tropical forage legume Stylosanthes guianensis（Aubl.）Sw[J]. Conservation Genetics Resources， 2009， 1（1）： 43-46.

[23] Botstein D， White R L， Skolnick M， et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. The American Journal of Human Genetics， 1980， 32（3）： 314-331.

[24] Vander Stappen J， Weltjens I， Van Campenhout S， et al. Genetic relationships among Stylosanthes species as revealed by sequence-tagged site markers[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1999， 98（6-7）： 1 054-1 062.

[25] Liu C J， Musial J M， Thomas B D. Genetic relationships among Stylosanthes species revealed by RFLP and STS analyses[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1999， 99（7-8）： 1 179-1 186.

[26] Gillies A C M， Abbott R J. Phylogenetic relationships in the genus Stylosanthes（Leguminosae）based upon chloroplast DNA variation[J]. Plant Systematics and Evolution， 1996， 200（3-4）： 193-211.

[27] Vander Stappen J， Marant S， Volckaert G. Molecular characterization and phylogenetic utility of the rDNA external transcribed spacer region in Stylosanthes（Fabaceae）[J]. Theoretical and Applied Genetics， 2003， 107（2）： 291-298.

[28] Calles T， Schultze-Kraft R. Re-establishment of Stylosanthes gracilis（Leguminosae）at species level[J]. Kew Bulletin， 2010， 65（2）： 233-240.