3個甘蔗與斑茅遠緣雜交后代BC1的染色體遺傳分析

黃永吉　符成　林煒樂　劉少謀　高嘉慧　鄧祖湖　黃忠興　林彥銓　陳如凱

摘 要 對3個甘蔗與斑茅遠緣雜交后代BC1進行真實性鑒定及染色體核型分析，以探討甘蔗與斑茅BC1的染色體傳遞方式。利用2對鑒定斑茅真實雜交后代的特異引物對3個甘蔗與斑茅BC1進行鑒定，采用根尖分生區細胞去壁低滲涂片法制片，顯微拍照計數染色體數目，并進行染色體核型分析。3個BC1材料均為斑茅的真實雜交后代，崖城01-69體細胞染色體核型公式為2n=121=120 m+1 sm，其染色體按2n+n方式傳遞；崖城01-116的體細胞染色體核型公式為2n=122=118 m+4 sm，其染色體傳遞方式為2n+n；崖城01-134的體細胞染色體核型公式為2n=121=120 m+1 sm，其染色體傳遞為2n+n。推斷甘蔗與斑茅BC1的染色體以2n+n的方式傳遞。

關鍵詞 甘蔗；斑茅；核型分析；染色體傳遞方式

中圖分類號 S334.3 文獻標識碼 A

Genetic Analysis of Chromosome in 3 BC1 Clones from

the Distant Crossing Between Saccharum spp.

and Erianthus arundinaceus

HUANG Yongji1， FU Cheng2 *， LIN Weile1， LIU Shaomou2， GAO Jiahui1

DENG Zuhu1 **， HUANG Zhongxing2， LIN Yanquan1， CHEN Rukai1

1 Key Lab of Sugarcane Biology and Genetic Breeding， Ministry of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350002， China

2 Guangzhou Research Institute for Sugarcane Industry， Guangzhou， Guangdong 510316， China

Abstract To explore the chromosome transmission， the karyotypes of 3 BC1 clones from the distant crossing between Saccharum spp. and Erianthus arundinaceus were analyzed. 3 BC1 clones were identified using 2 pairs of specific primers of true E. arundinaceus progenies. Chromosomes were prepared according to cell wall degradation hypotonic smear method， the chromosomes number of 3 BC1 clones was calculated and the karyotypes of 3 BC1 clones were analyzed. 3 BC1 clones were true progenies of E. arundinaceus. The somatic chromosome karyotypic type of YC01-69 was 2n=121=120 m+1 sm， following 2n+n transmission； The somatic chromosome karyotypic type of YC01-116 was 2n=122=118 m+4 sm， following 2n+n transmission； The somatic chromosome karyotypic type of YC01-134 was 2n=121=120 m+1 sm， following 2n+n transmission. The 2n+n transmission of BC1 clones from Saccharum spp. and E. arundinaceus can be resumed.

Key words Sugarcane； Erianthus arundinaceus； Karyotype analysis； Chromosome transmission

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.010

甘蔗是中國乃至世界最重要的糖料作物和具有較好發展前景的糖能兼用的可再生生物能源作物[1]，全球蔗糖產量約占食糖總產量的75%[2]。現代甘蔗栽培品種（Saccharum spp. L.）主要來源于幾個熱帶種也被稱為高貴種（Saccharum officinarum）和不多的野生種割手密（Saccharum spontaneum）的雜交后代，導致其遺傳基礎相對狹窄[3-4]，制約了甘蔗產量的進一步提高。

蔗茅屬、芒屬、硬穗茅屬和河八王屬等甘蔗近緣屬野生種是拓寬甘蔗遺傳基礎的重要種質資源[5]，世界各國甘蔗育種者陸續在這些種質資源的收集、保存和利用等方面開展了大量的工作。其中，斑茅（Erianthus arundinaceus）屬于蔗茅屬植物[6]，因其具有高生物量、生勢旺盛、分蘗力強、宿根性好和耐澇、耐瘠、抗旱、抗病蟲能力強等優勢[7-12]，備受甘蔗育種者親睞。期望通過屬間遠緣雜交進行種質創新，將甘蔗近緣屬野生種的優良基因滲透到甘蔗中，豐富其遺傳背景，創制出抗逆、高產、高糖的超親良種[13-14]。長期以來，由于甘蔗與斑茅F1高度不育和雜交后代遺傳機理不明，導致斑茅的雜交利用進展緩慢。經過甘蔗育種者的不懈努力，斑茅種質研究與利用取得重要進展，已突破BC1，成功獲得甘蔗與斑茅更高世代的真實雜交后代[7，9，12，15-17]，其中有些材料的性狀表現優良，具有良好的利用價值。然而，由于甘蔗是高度復雜的異源多倍體或非整倍體植物[18]，其染色體較小且數目眾多（100～130條）[19]，染色體制片十分困難。此外，染色體中期相比率低，導致甘蔗細胞遺傳學研究進展滯后于其他作物。

開展對甘蔗與斑茅雜交后代的細胞遺傳學研究，對斑茅等近緣屬野生種種質資源利用研究具有重要的指導意義。本文對3個甘蔗與斑茅BC1崖城01-69、崖城01-116和崖城01-134進行染色體核型分析，旨在對甘蔗與斑茅BC1的染色體遺傳特點進行研究，將有助于提高斑茅在甘蔗遺傳改良育種上的利用效率，并提供一定的細胞遺傳學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究材料為Badila、海南斑茅92-77、海南斑茅92-105、崖城96-40、崖城96-66、CP84-1198、崖城01-69、崖城01-116、崖城01-134（圖1），斑茅及其后代無性系來自廣州甘蔗糖業研究所海南甘蔗育種場，保育在福建農林大學甘蔗綜合研究所資源圃。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取和雜交后代真實性分子鑒定

參考SM Aljanabi等[20]的CTAB法提取供試材料葉片的總基因組DNA。根據本實驗室開發的2對鑒定斑茅真實雜交后代的特異引物（EF1和ER1；EF2和ER2）[21]對供試材料進行雜交后代真實性分子鑒定，用美國ABI 梯度PCR儀（VeritiTM 96）進行擴增。反應總體積為25 μL，包括2.5 ng基因組DNA，1×Ex Taq PCR Buffer，dNTPs Mixture各2.5 mmol/L，正向和反向引物各0.4 μmol/L，1.25 U TaKaRa Ex Taq。反應程序為95 ℃預變性5 min；93 ℃變性50 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，30個循環；72 ℃終延伸5 min。

1.2.2 染色體制片 參考黃東益[22]和鄧祖湖等[23]的方法，28 ℃保濕培養根尖至1.5 cm，切取1 cm左右的根尖于對二氯苯飽和水溶液處理2 h，再用無水乙醇和冰醋酸（3 ∶ 1）溶液固定24 h，固定后的根尖0.075 mol/L KCl中低滲1 h，3.5%纖維素酶和1.75%果膠酶混合液在37 ℃酶解8～12 h。酶解后根尖置于蒸餾水中低滲30～60 min，無水乙醇和冰醋酸（3 ∶ 1）溶液固定30 min。將根尖分生區切下，均勻涂抹于載玻片上，空氣干燥后用pH6.8的Giemsa染液染色。用Carl Zeiss Scope.A1顯微鏡觀察，MRC5相機拍照。

1.2.3 染色體核型分析 每個材料選取30個染色體分散較好的中期細胞進行染色體數目的統計，選取典型的中期細胞進行測量，制成染色體參數表，繪制核型模式圖，選擇具有代表性的分裂相排成核型。核型分析參照李懋學等[24]的標準，染色體的相對長度、臂比類型按Levan等[25]命名系統確定，核型類型參考Stebbins[26]的標準分類，染色體類型采用Kuo等[27]的方法進行劃分。用Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics， Inc.）測量染色體長度，用Microsoft Excel 2013軟件分析作圖，核型分析方法參考李懋學等[24]的方法，但考慮到甘蔗為異源多倍體，染色體不進行配對，本文染色體核型分析按其長度從長到短排列，單條染色體核型分析不配對。

2 結果與分析

2.1 甘蔗與斑茅雜交后代BC1雜交后代真實性鑒定

利用2對鑒定斑茅真實雜交后代特異引物（EF1和ER1；EF2和ER2）對Badila、海南斑茅92-77、海南斑茅92-105、崖城96-40、崖城96-66、CP84-1198、崖城01-69、崖城01-116、崖城01-134進行鑒定。結果顯示，海南斑茅92-77、海南斑茅92-105、崖城96-40、崖城96-66、崖城01-69、崖城01-116、崖城01-134都擴增出斑茅特異條帶，而Badila和CP84-1198沒有擴增出特異條帶（圖2），說明崖城01-69、崖城01-116、崖城01-134為甘蔗與斑茅的真實雜交后代。

2.2 3個甘蔗與斑茅BC1核型分析結果

2.2.1 崖城01-69核型分析結果 崖城01-69的核型參數見表1，其體細胞染色體數為2n=121，相對長度介于0.28～1.51，最長染色體/最短染色體為5.42，臂比范圍介于1.01～1.90，平均臂比為1.19，染色體屬1C型。121條染色體中有120條為中部著絲粒染色體，1條為近中部著絲粒染色體，核型公式為2n=121=120 m+1 sm，染色體形態和核型模式見圖3、4。

2.2.2 崖城01-116核型分析結果 崖城01-116的核型參數見表1，其體細胞染色體數為2n=122，相對長度介于0.49～1.62，最長染色體/最短染色體為3.32，臂比范圍介于1.01～1.96，平均臂比為1.21，染色體屬1B型。122條染色體中有118條為中部著絲粒染色體，4條為近中部著絲粒染色體，核型公式為2n=122=118 m+4 sm。染色體形態和核型模式圖見圖5、6。

2.2.3 崖城01-134核型分析結果 崖城01-134的核型參數見表1，其體細胞染色體數為2n=121，相對長度介于0.38～1.32，最長染色體/最短染色體為3.49，臂比范圍介于1.01～1.71，平均臂比為1.17，染色體屬1B型。121條染色體中有120條為中部著絲粒染色體，1條為近中部著絲粒染色體，核型公式為2n=121=120 m+1 sm，染色體形態和核型模式圖見圖7、8。

3 討論與結論

甘蔗是中國最重要的糖料作物，中國作為一個重要的食糖生產國和消費國，食糖產業的重要戰略性不言而喻。然而，全球甘蔗商業栽培品種的改良是通過利用十分有限的種質資源完成的。因此，利用野生種種質資源擴大甘蔗遺傳基礎，并進行雜交育種提高甘蔗產量顯得尤為重要。斑茅等近緣屬野生種是甘蔗遺傳育種重要的種質資源，其具有極其豐富和寶貴的潛在基因資源，通過甘蔗與斑茅屬間雜交培育具有適應性廣、抗逆強、高產、穩產、優質的新良種，對甘蔗育種具有重要意義。

縱觀甘蔗品種改良育種史，每次甘蔗遺傳改良育種瓶頸得以突破都有新的種質資源滲入[28]。Jeswiet的“高貴化”育種和Ven Katraman的“三元雜種”創造了半個世紀甘蔗糖業的輝煌成就。其中，Jeswiet首創高貴種與野生種割手密的高貴化雜交育種，經過2次2n+n的染色體遺傳方式，這種遺傳方式加速了高貴化進程，不僅累積了高貴種的優良血統，同時又削弱了野生種的不良血統[29]。甘蔗育種者認為割手密的BC2、BC3即可培育出具備高貴種的高產高糖特性與野生種的強活力、強抗性的良種，高貴化次數過多，反而可能會使抗性和活力降低。因此，開展甘蔗野生種種質資源的遺傳背景和遺傳方式研究是實現甘蔗遺傳育種新突破的關鍵。

甘蔗染色體傳遞方式十分復雜，有n+n、2n+n、n+2n和2n+2n等傳遞方式，并且n常常不是一倍體的原來數目，常有增減，Bremer將這種配子數目常有增減的現象稱為“不平衡遺傳”[30]。甘蔗性細胞減數分裂出現異常時，配子增減幾條染色體甚至是染色體加倍，仍然能夠結合成受精卵，并正常地發育生長成完整植株和完成整個生育期的特性，筆者將這種具備雌雄配子非正常結合成受精卵的相容現象稱之為“容錯現象”。甘蔗染色體減數分裂很不規則，其可能會出現染色體提早進入中期，推遲進入后期，在末期和四分體即形成核仁，小孢子染色體數無規則，形成非整倍體后代等[31]。甘蔗染色體配對雖大多以二價體為主，但也存在單價體和多價體，多價體配對反映出同源聯會不完全[19]。

甘蔗與斑茅有性雜交的F1染色體遺傳方式為n+n，高貴種的染色體未加倍，BC1染色體遺傳方式是2n+n，含斑茅血緣的F1的染色體被完整保留下來，而較為“高貴”的父本CP84-1198的染色體減半，這種染色體遺傳方式使高貴化進程減慢，可能需要在更高世代中才能獲得含有斑茅血緣的良種。由于甘蔗屬熱帶種和斑茅遠緣雜交獲得的F1高度不育，難以達到轉移有利基因的目的，一些甘蔗育種者將割手密作為橋梁親本，先利用割手密與斑茅雜交，獲得的F1聚合了雙親優點以及較好的花粉育性，可進一步利用這些具備雙親優異基因的F1再與其他甘蔗栽培品種雜交，創制出新的突破性優良種質[32-33]，或許這是克服F1高度不育而帶來的諸多不利的途徑之一。

本研究從3個甘蔗與斑茅BC1的斑茅后代真實性鑒定和核型分析結果可以看出：經2對斑茅真實雜交后代特異引物鑒定，崖城01-69、崖城01-116和崖城01-134都出現了斑茅的特異條帶，說明這3個材料均為甘蔗與斑茅的真實雜交后代。3個甘蔗與斑茅BC1無性系崖城01-69、崖城01-116和崖城01-134的染色體均由中部著絲點和近中部著絲點組成，分別屬1C型、1B型和1B型，這與鄭成木[34]、劉文榮等[35]、黃東益等[36]、鄧祖湖等[23，37]的研究結果基本一致，他們均認為甘蔗染色體多以中部著絲點染色體為主。Stebbins[26]認為，高等植物核型進化的基本趨勢是由對稱向不對稱發展的，較原始的植物的核型具對稱的中部著絲點染色體較多，而較進化的植物的核型具中部著絲點染色體較少。因此，3個甘蔗與斑茅BC1染色體較原始。崖城01-69為121條染色體，崖城01-116為122條染色體，崖城01-134為121條染色體，母本崖城96-40為69條染色體，母本崖城96-66為69條染色體，父本CP84-1198為120條染色體，因此，如果經過正常的減數分裂，母本崖城96-40的配子有34或者35條染色體，母本崖城96-66的配子有34或者35條染色體，父本CP84-1198的配子有60條染色體。若按n+n傳遞，崖城01-69、崖城01-116和崖城01-134的染色體應為2n=94或95；若按n+2n傳遞，崖城01-69、崖城01-116和崖城01-134的染色體應為2n=154或155；按2n+n，崖城01-69、崖城01-116和崖城01-134的染色體應為2n=129，較為符合。因此，推斷BC1以2n+n的方式進行傳遞，與Piperidis等的結果一致[16]。

參考文獻

[1]張躍彬，吳才文，劉家勇，等. 現代甘蔗產業技術國內外發展狀況及建議[J]. 中國糖料， 2008（4）： 54-65.

[2]World Sugar Statistics F O. Licht's world sugar year book. 72nd edn[M]. Informa， 2011.

[3]Lu Y h，D'hont A，Walker Dit，et al. Relationships among ancestral species of sugarcane revealed with RFLP using single copy maize nuclear probes[J]. Euphytica， 1994， 78（1-2）： 7-18.

[4]Irvine J E. Saccharum species as horticultural classes[J]. Theoretical and Applied Genetics，1999，98（2）： 186-194.

[5]Singh R K，Singh R B，Singh S P，et al. Identification of sugarcane microsatellites associated to sugar content in sugarcane and transferability to other cereal genomes[J]. Euphytica，2011，182（3）：335-354.

[6]Amalraj V Alfonse，Balasundaram N. On the taxonomy of the members of‘Saccharum complex[J]. Genetic Resources and Crop Evolution，2006，53（1）：35-41.

[7]D'hont A，Rao P S，Feldmann P，et al. Identification and characterisation of sugarcane intergeneric hybrids，Saccharum officinarum × Erianthus arundinaceus，with molecular markers and DNA in situ hybridisation[J]. Theoretical and Applied Genetics，1995，91（2）：320-326.

[8]Rott P，Mohamed I S，Klett P，et al. Resistance to leaf scald disease is associated with limited colonization of sugarcane and wild relatives by Xanthomonas albilineans[J]. Phytopathology，1997，87（12）：1202-1213.

[9]Piperidis G，Christopher M J，Carroll B J，et al. Molecular contribution to selection of intergeneric hybrids between sugarcane and the wild species Erianthus arundinaceus[J]. Genome，2000，43（6）：1 033-1 037.

[10]Ram Bakshi，Sreenivasan T V，Sahi B K，et al. Introgression of low temperature tolerance and red rot resistance from Erianthus in sugarcane[J]. Euphytica，2001，122（1）：145-153.

[11]Sugimoto Akira，Ponragdee Werapon，Sansayawichai Taksina，et al. Collecting and evaluating of wild relatives of sugarcane as breeding materials of new type sugarcane cultivars of cattle feed in Northeast Thailand[C]. Japan International Research Center for Agricultural Sciences：JIRCAS Working Report，2002， （30）：55-60.

[12]Cai Q，Aitken K S，Fan Y H，et al. A preliminary assessment of the genetic relationship between Erianthus rockii and the“Saccharum complex”using microsatellite（SSR） and AFLP markers[J]. Plant Science，2005，169（5）：976-984.

[13]Tai P Y P，Miller J D. A Core Collection for Saccharum spontaneum L. from the World Collection of Sugarcane[J]. Crop science，2001，41（3）：879-885.

[14]Tai Pyp，Miller Jd. Germplasm diversity among four sugarcane species for sugar composition[J]. Crop science，2002，42（3）：958-964.

[15]鄧海華，廖兆周，李奇偉，等. 斑茅F2雜種選育與同工酶標記輔助選擇[J]. 甘蔗糖業，2002（1）：1-5.

[16]Piperidis N，Chen J W，Deng H H，et al. GISH characterization of Erianthus arundinaceus chromosomes in three generations of sugarcane intergeneric hybrids[J]. Genome，2010，53（5）：331-336.

[17]Fukuhara S，Terajima Y，Irei S，et al. Identification and characterization of intergeneric hybrid of commercial sugarcane （Saccharum spp. hybrid） and Erianthus arundinaceus（Retz.） Jeswiet[J]. Euphytica，2013，189（3）：321-327.

[18]D'hont Angelique，Grivet Laurent，Feldmann Philippe，et al.Characterisation of the double genome structure of modern sugarcane cultivars（Saccharum spp.） by molecular cytogenetics[J]. Molecular and General Genetics，1996，250（4）：405-413.

[19]Jannoo N，Grivet L，David J，et al. Differential chromosome pairing affinities at meiosis in polyploid sugarcane revealed by molecular markers[J]. Heredity，2004，93（5）：460-467.

[20]Aljanabi Sm，Forget L，Dookun A. An improved and rapid protocol for the isolation of polysaccharide and polyphenol-free sugarcane DNA[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1999，17（3）：281.

[21]鄭雪芳. 甘蔗近緣屬植物斑茅的利用與真實雜種鑒定研究[D]. 福建福州：福建農林大學，2004.

[22]黃東益. 栽培甘蔗染色體組構成的細胞學分析與原位雜交檢測的研究[D]. 海南儋州：華南熱帶農業大學，1999.

[23]鄧祖湖，賴麗萍，林煒樂，等. 甘蔗斑茅雜交后代BC1的染色體核型及染色體遺傳分析[J]. 福建農林大學學報：自然科學版，2007（36）：561-566.

[24]李懋學，陳瑞陽. 關于植物核型分析的標準化問題[J]. 武漢植物學研究，1985（3）：297-302.

[25]Levan Albert，Fredga Karl，Sandberg Avery A. Nomenclature for centromeric position on chromosomes[J]. Hereditas，1964，52（2）：201-220.

[26]Stebbins George Ledyard. Chromosomal evolution in higher plants[M]. London：Edward Arnold，1971：87-89.

[27]Kuo Shing-Rong，Wang Tze-Ting，Huang Tseng-Chieng.Karyotype analysis of some formosan gymnosperms[J]. Taiwania，1972，17（1）：66-80.

[28]Jackson Phillip A.Breeding for improved sugar content in sugarcane[J]. Field Crops Research，2005，92（2）：277-290.

[29]Bremer G. Problems in breeding and cytology of sugar cane[J]. Euphytica，1961，10（1）：59-78.

[30]Bremer G. A cytological investigation of some cultivated kinds and of their parents[J]. Genetica，1924，6：497-525.

[31]張 華，林彥銓. 甘蔗細胞與分子遺傳學研究進展[J]. 甘蔗，2001，8（3）：1-6.

[32]高軼靜，方鋒學，劉昔輝，等. 甘蔗與斑茅割手密復合體雜交后代的分子標記鑒定[J]. 植物遺傳資源學報，2012（13）：912-916.

[33]Govindaraj P，Balamurugan A，Natarajan U S. Identification of intergeneric hybrids between Erianthus arundinaceus and Saccharum spontaneum through STMS markers[J]. International Sugar Journal，2012，114（1 361）：350-356.

[34]鄭成木. 甘蔗核型及其染色體數目變化的研究[J]. 熱帶作物學報，1993（14）：47-51.

[35]劉文榮，鄧祖湖，張木清，等. 甘蔗斑茅的雜交利用及其雜種后代鑒定系列研究Ⅲ. 甘蔗斑茅遠緣雜交后代細胞遺傳分析[J]. 作物學報，2004（30）：1 093-1 096.

[36]黃東益，鄭成木，莊南生，等. 甘蔗染色體組構成系統演化的研究[J]. 熱帶作物學報，2000（21）：43-51.

[37]鄧祖湖，李玉蟬，劉文榮，等. 甘蔗和斑茅遠緣雜交后代的染色體遺傳分析[J]. 熱帶作物學報，2007（28）：62-67.