茶樹P5CS基因克隆及其在滲透和高鹽脅迫下的表達分析

王麗珊　林清凡　陳蘭平　池福鈴　郭春芳　張積森

摘 要 △1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是植物脯氨酸合成過程中的關鍵酶。應用同源克隆方法獲得茶樹P5CS，序列長為1 316 bp，編碼323個氨基酸；其編碼蛋白分子量為34.7 ku，pI為7.62；N端有1個氨基酸激酶超家族[Amino Acid Kinases（AAK） superfamily]功能區，C端有1個醛脫氫酶超家族[Aldehyde Dehydrogenas（ALDH）superfamily]功能區，預測為親水性跨膜蛋白；對18個物種的P5CS進行聚類分析，結果生物學分類及進化關系吻合。并與美味獼猴桃高度同源，相似度達89%。應用實時熒光定量PCR分析表明，該基因轉錄本在水分脅迫24 h內升至對照組水平的2.6倍，而高鹽脅迫48 h后才升至9.9倍的最高值；水分脅迫應答速度快，但相對表達量較高鹽脅迫低。由此推測該基因被誘導參與了滲透脅迫應答響應，并且對滲透脅迫中的旱害脫水更為敏感。

關鍵詞 茶樹；P5CS；實時熒光定量PCR；水分脅迫；高鹽脅迫

中圖分類號 S571.1 文獻標識碼 A

Cloning and Expression Analysis of P5CS Gene

under Drought and Salinity Stress

in Camellia sinensis

WANG Lishan1，2，3， LIN Qingfan1，2，3， CHEN Lanping1，2，3， CHI Fuling1，2，3

GUO Chunfang4 *， ZHANG Jisen1，2，3

1 College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350108， China

2 Key Lab for Sugarcane Genetic Improvement， Ministry of Agriculture， Fuzhou， Fujian 350108， China

3 Genomics and Biotechnology Research Center， Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou， Fujian 350002， China

4 Fujian Institute of Education， Fuzhou， Fujian 350025， China

Abstract △1-pyrroline-5-carboxylate synthetase（P5CS）is considered to be the key enzyme for proline biosynthesis in plant. In the study，a 1 316 bp-length cDNA fragment of P5CS was cloned from Camellia sinensis cv. Tieguanyin through homology-based cloning strategy. The cDNA encodes a polypeptide with 323 amino acids containing an amino acid kinases domain in N terminal and an aldehyde dehydrogenase motif in C-terminus. Based on the conserved domain search analysis in NCBI，the deducted polypeptide was predicted to be a hydrophilic transmembrane protein. The BLAST results showed that the fragment shared 89% similarity with Actinidia deliciosa（ADU92286）. Phylogenetic analysis of P5CS from different species showed an evolutional consistency between the gene and higher plant. Moreover，the expression patterns of CsP5CS under the drought and salt stress were detected by real-time quantitative PCR. The CsP5CS gene expression level of the plant with 24 h PEG stress and 48 h high-salt stress was 2.6 and 9.9 times，respectively，as the control. The significant up-regulation expression under both PEG and salt stress treatments suggested that CsP5CS involved in the response to osmotic stress and might function to dehydration resistance by relegating the accumulation of proline. Meanwhile，CsP5CS is more sensitive to drought stress than salinity stress in the response to osmotic stress.

Key words Camellia sinensis； P5CS； Real-time quantitative PCR； Drought stress； Salinity stress

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.012

土壤水分是茶樹生理與生態需水的主要來源，旱害給茶樹生長、茶葉產量和品質帶來較大影響。脯氨酸是植物面對水分和高鹽脅迫積累的最為重要的滲透調節物質，以增強自身對滲透脅迫的抵抗能力[1-3]。一般認為脯氨酸的生物合成途徑有2種，即谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑[4-5]。其中谷氨酸途徑中的關鍵酶是△1-吡咯琳-5-羧酸合成酶（△1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS：EC2.7.2.11/1.2.2.41）[6-13]。近年有關茶樹抗旱性與葉片組織中脯氨酸含量變化的動態關系其研究結果不盡相同。王守生[14]、吳伯千[15]、Handique等[16]認為脯氨酸的積累與茶樹滲透調節呈正相關；伍炳華[17]、李華均[18]、李金昌[19]認為脯氨酸的積累與茶樹滲透調節無明確關系；潘根生等[20-21]認為茶樹的脯氨酸積累與茶樹滲透調節無明確關系，但與茶樹的品種有關。

目前，對茶樹抗旱的分子機制研究尚處于初期階段。為了探討茶樹水分、高鹽脅迫下脯氨酸代謝關鍵基因P5CS的分子調控機制，本研究選用茶樹鐵觀音為研究材料，運用同源克隆技術克隆茶樹鐵觀音中谷氨酸途徑中的關鍵酶基因P5CS；利用生物信息學方法對基因的功能進行預測分析；采用實時熒光定量PCR技術對水分脅迫和高鹽脅迫下該基因的表達特征進行分析，以期為提高茶樹抗旱基因工程奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料為福建安溪1年生的鐵觀音（Camellia sinensis cv. Tie-guanyin）茶樹扦插苗。

1.1.2 試劑 Prime ScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit、Taq DNA聚合酶、pMD19-T Vector Kit、SYBR染料、Dnase I購自TaKaRa公司，E.coli DH5α由本實驗室保存，引物合成及測序由上海生工生物工程公司完成，其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 選擇生長情況、大小基本一致的1年生的鐵觀音（Camellia sinensis cv. Tie-guanyin）茶樹扦插苗，移栽至1/2劑量的Hoagland營養液修復培養，置于玻璃溫室自然光照，每天定時通氣，3 d后用分別用25%聚乙二醇（PEG-6000）溶液和200 mmol/L NaCl溶液，模擬水分脅迫和高鹽脅迫進行培養，對照為1/2劑量的Hoagland營養液水培，重復5次，分別為對照0（K0）、24（K1）、48（K2）、72 h（K3）；25% PEG 處理0（P0）、24（P1）、48（P2）、72 h（P3）；200 mmol/L NaCl處理0（N0）、24（N1）、48（N2）、72 h（N3）；取每組的茶樹幼苗芽下第2、3葉片，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存備用（表1）。

1.2.2 茶樹鐵觀音葉片組織總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成 采集經過水分、高鹽脅迫處理的茶樹鐵觀音幼苗芽下第2、3葉片組織為實驗材料提取總RNA，提取方法參照宛曉春[22]改良CTAB法，運用購自TaKaRa公司的Dnase I 對茶樹基因組DNA消化處理。取適量茶樹葉片組織總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析質量。以消化處理后的茶樹葉片組織總RNA為模板，參照TaKaRa公司的Prime ScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit操作說明，以oligo（dT）和Random 6 mers為逆轉錄引物合成cDNA第一鏈。

1.2.3 茶樹鐵觀音P5CS的克隆與測序 利用同源克隆的方法，在NCBI核酸數據庫中檢索近緣植物的△1-吡咯琳-5-羧酸合成酶基因序列，主要參照葡萄（Vitis vinifera）（XM_002282319.2）、美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）（ADU92286）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）（NM_115419.4）、歐洲大葉楊（Populus trichocarpa）（XM_002315166.1）、大豆（Glycine max）（NM_00125122-4.1）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）（XM_003568279.1）、番茄（Solanum lycopersicum）（NM_001246978.1）、蓖麻（Ricinus communis）（XM_002524184.1）的P5CS序列，選擇高度保守的區段，設計如下2對同源引物（PS1-F、PS1-R、PS2-F、PS2-R）分別進行PCR擴增（表2）。反應體系為25 μL：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ExTaq酶0.5 μL。反應條件為：94 ℃ 5 min預變性；94 ℃ 30 s變性，57 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，進行35個循環；72 ℃ 10 min。回收擴增產物，利用pMD19-T載體，轉化到E.coli DH5α，挑取陽性克隆，由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4 茶樹鐵觀音P5CS核苷酸序列，氨基酸序列分析和系統進化樹構建 運用BioEdit軟件將得到的序列進行電子拼接，同源比對驗證；運用ORF Finder在線軟件（http：//www.n-cbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）預測序列的開放閱讀框；運用ExPASy在線工具對編碼蛋白的等電點、分子量等理化性質進行分析；運用NCBI數據庫的CDD程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/c dd/wrpsb.c-gi）分析編碼蛋白的保守結構域；運用TMHMM在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測跨膜結構；運用HNN在線軟件（http：//npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_hnn.html）分析編碼蛋白的二級結構；利用SignalP在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析編碼蛋白的信號肽；通過MEGA 5.0軟件對克隆獲得的茶樹鐵觀音P5CS與其他近緣物種P5CS進行同源性比對并構建系統進化樹發育分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 根據所克隆的茶樹鐵觀音P5CS，運用Primer 5.0軟件設計實時熒光定量PCR引物（RP-F、 RP-R），所選用內參基因為β-Actin（A-F、A-R）（表2）。將水分、高鹽脅迫處理下的茶樹鐵觀音葉片組織的cDNA，參照Bio-Rad SsoAdvanced SYBR Green Supermix Kit操作說明，在Bio-Rad CFX Manager 3.0上對目的基因進行實時熒光定量PCR檢測。反應體系為20 μL：SsoAdvanced SYBR Green Supermix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。反應程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，循環40次。運用2-△△CT法[23]分析計算茶樹鐵觀音P5CS的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 茶樹鐵觀音葉片組織總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

電泳結果顯示28 S rRNA和18 S rRNA條帶清晰明亮，兩者的比例大約為2 ∶ 1，并且5 S條帶清晰可見，說明RNA較完整，質量良好。將茶樹鐵觀音葉片組織總RNA逆轉錄合成cDNA第一鏈，經檢測，質量達到后續實驗的要求。

2.2 茶樹鐵觀音P5CS片段的克隆

根據NCBI數據庫中茶樹鐵觀音近緣植物的P5CS序列，設計2對引物，經多輪PCR擴增得到兩條片段，電泳結果顯示約為800 bp和1 000 bp的片段，擴增特異性良好，與預計的目的片段長度相似（圖1）。測序后通過Blast分析比對，證實為P5CS片段序列。

2.3 茶樹鐵觀音CsP5CS片段的生物信息學分析

2.3.1 CsP5CS核苷酸序列分析 將測序后的片段進行拼接，獲得P5CS基因片段長為1 316 bp，預測其編碼一個長為323個氨基酸的多肽片段。該基因編碼的蛋白質分子質量為34.7 ku，pI為7.62。將所克隆的茶樹鐵觀音P5CS命名為CsP5CS。將茶樹鐵觀音CsP5CS的核苷酸序列在NCBI數據庫中進行Blast比對，發現其與以下物種的P5CS有較高的同源性：美味獼猴桃（O04015.1）、蠟燭果（Aegiceras corniculatum，AAW50846.1）、歐洲大葉楊（XP_002315202.1）、麻瘋樹（Jatropha curcas，GU358610.1）、湖北海棠（Malus hupehensis，JF742986.1）、 胡楊（Populuse uphratica，EF412967.1）、蓖麻（XM_

002524184.1）、葡萄（NM_001281205.1），同源性分別為89%、84%、83%、83%、83%、83%、83%、83%。測序結果和核苷酸序列的同源性比對驗證了該基因的準確性。

2.3.2 CsP5CS氨基酸序列分析 根據網站預測參數，其不穩定系數為38.25，不穩定系數大于40時為不穩定蛋白，由此預測該蛋白是一個不穩定蛋白。CsP5CS的GRAVY值為0.11，結合ProtScale親/疏水性分析結果，預測該蛋白為親水性蛋白。蛋白質疏水性分析對于研究其跨膜特征和二級結構有著重要的指導意義，通常認為，氨基酸分值越低親水性越強，分值越高疏水性越強。CsP5CS氨基酸序列的第170位氨基酸分值最高，為2.822，疏水性最強；第202位氨基酸分值最低，為-2.167，親水性最強。就整體分析而言，親水性氨基酸均勻分布在整個多肽鏈中，沒有明顯的疏水性區域，因此，推測CsP5CS是一個親水性蛋白（圖2）。利用TMHMM在線軟件，預測CsP5CS氨基酸序列跨膜區段結果顯示，1～6位氨基酸在膜內，7～29位氨基酸為跨膜螺旋，30～323位氨基酸在膜外。因此，推測該基因編碼的蛋白為跨膜蛋白（圖3）。利用HNN在線軟件，預測CsP5CS蛋白質二級結構結果顯示，CsP5CS的肽鏈有129個氨基酸參與α-螺旋結構，占39.94%；有71個氨基酸參與延伸鏈結構，占21.98%；有123個氨基酸參與無規則卷曲結構，占38.08%；整體分析，α-螺旋和無規則卷曲結構占大多數（圖4）。利用SignalP在線軟件，預測CsP5CS的信號肽結果顯示，原始剪切位點分值（C值）、信號肽分值（S值）和綜合剪切位點分值（Y值）均比較低，無氨基酸殘基位點，因此，可能不存在信號肽，是一個非分泌蛋白（圖5）。利用NCBI數據庫對CsP5CS蛋白的結構域進行分析，結果顯示該基因編碼蛋白在N端有1個氨基酸激酶超家族[Amino Acid Kinases（AAK）superfamily]功能區，在C端有1個醛脫氫酶超家族[Aldehyde Dehydrogenase（ALDH）superfamily]功能區。該超家族成員在生物體內執行著多種功能，其表達與膨壓和滲透脅迫相關（圖6）。

2.3.3 系統進化樹分析 將本研究獲得CsP5CS的氨基酸序列與其他17個物種的P5CS氨基酸序列構建鄰接（Neighbor joining）系統進化樹（圖7）。圖中可分為3組，CsP5CS與中華獼猴桃、美味獼猴桃、蠟燭果、擬南芥、葡萄等雙子葉植物聚為一類，雙子葉植物中親緣關系最近及遠依次為美味獼猴桃（A. deliciosa）、中華獼猴桃（A. chinensis）、蠟燭果（A. corniculatum）、煙草（N. tabacum）、多裂水茄（Solanumtorvum）、馬鈴薯（S. tuberosum）、蕃茄（S. lycopersicum）、葡萄（V. vinifera）、黃瓜（C. sativus）、擬南芥（A. thaliana）、玉米（Z. mays）、水稻（O. sativa）、二穗短柄草（B. distachyon）等單子葉植物聚為一類。動物界的親緣關系由近及遠為秀麗隱桿線蟲（C. elegans）、熱帶爪蟾（X. tropicalis）、人類（H. sapiens）、小鼠（M. musculus）。由P5CS的無根進化樹可以看出，植物中單子葉植物與雙子葉植物的P5CS能聚為一簇，這與單雙子葉植物進化過程一致。動物的P5CS也可以聚成一簇。結果與形態學上分類的進化關系基本一致，基本上可反映該基因的進化規律和物種進化的協同關系。其中，CsP5CS與雙子葉植物中的中華獼猴桃和美味獼猴桃親緣關系最近，可推測由同一祖先經不同的途徑進化而來。

2.4 水分、高鹽脅迫處理下CsP5CS在葉片組織中的表達分析

實時熒光定量PCR中融解曲線（圖8）分析表明，CsP5CS與內參基因（β-Actin）的融解曲線均為銳利的單峰型，且Tm值在80～85 ℃之間，表明擴增產物特異性好，無非特異擴增，且無引物二聚體。擴增曲線分析表明，CsP5CS與內參基因（β-Actin）的擴增曲線均呈S形，有明顯的指數擴增區，符合數據要求。

運用2-△△CT法計算CsP5CS的相對表達量（圖9）。結果顯示，茶樹鐵觀音幼苗在水分脅迫（25% PEG）處理下，葉片組織中CsP5CS表達水平呈“先上升后下降”的趨勢。水分脅迫處理0～24 h之間，CsP5CS表達量呈上升趨勢；水分脅迫處理24 h，CsP5CS相對表達量最高，為對照組的2.6倍；水分脅迫處理24～72 h，CsP5CS表達量呈下降趨勢；水分脅迫處理48 h，CsP5CS表達量比對照組高，為對照組的1.9倍；水分脅迫處理72 h，CsP5CS表達量比對照組低，為對照組的0.6倍。茶樹鐵觀音幼苗在高鹽脅迫（200 mmol/L NaCl）處理下，葉片組織中CsP5CS表達水平呈“持續上升”趨勢。高鹽脅迫處理0～72 h之間，CsP5CS表達量都呈上升趨勢；高鹽脅迫處理72 h，CsP5CS表達量最高，為對照組的9.9倍；高鹽脅迫處理0～24 h時，CsP5CS表達量差異不顯著，高鹽脅迫處理24 h，CsP5CS表達量比對照組高，為對照組的1.1倍；高鹽脅迫處理24～72 h之間，CsP5CS表達量差異顯著，明顯高于對照組，高鹽脅迫處理48 h，CsP5CS表達量比對照組高，為對照組的2.8倍。以上數據可以推測CsP5CS基因是茶樹鐵觀音響應滲透脅迫應答基因之一，茶樹鐵觀音CsP5CS基因對2種脅迫的應答速度不同，干旱脅迫處理下的應答速度較高鹽脅迫下的應答速度快，且干旱脅迫處理下CsP5CS基因相對表達量較高鹽脅迫處理下低。

2.5 水分、高鹽脅迫處理下茶樹鐵觀音幼苗表型變化

水分脅迫處理下，茶樹葉片于24 h開始萎蔫，隨著時間延長葉片萎蔫程度逐漸加重，葉片和葉柄的夾角隨時間的延長逐漸變小。水分脅迫處理72 h，葉片萎蔫程度最嚴重，葉片卷曲程度大，葉片顏色由綠色變褐色，已接近枯萎，葉片和葉柄的夾角為3個處理組中最小。高鹽脅迫處理下，茶樹葉片于48 h開始萎蔫，隨著時間延長葉片萎蔫程度略微加重，葉片和葉柄的夾角隨時間的延長略微變小。高鹽脅迫處理72 h，葉片萎蔫程度較輕，葉片卷曲程度小，顏色仍為綠色，與對照組相比，葉片和葉柄的夾角略微變小。

3 討論與結論

脯氨酸是植物面對干旱和高鹽脅迫，積累的最為重要的滲透調節物質[1-3]。P5CS作為脯氨酸生物合成中的限速酶，在脯氨酸的合成過程中起著至關重要的作用[6-12]。本研究中，首次以茶樹鐵觀音作為實驗村料，利用同源克隆的方法，克隆得到茶樹鐵觀音P5CS，并命名為CsP5CS。通過生物信息學分析，該基因推導的氨基酸序列與已知的其它物種該基因的氨基酸序列比對發現同源性均在83%以上，說明該基因在生物進化上具有高度保守性。該基因推導的蛋白預測為親水性跨膜蛋白。蛋白質N端有1個氨基酸激酶超家族功能區，在C端有1個醛脫氫酶超家族功能區。該超家族成員在生物體內執行著多種功能，其表達主要與膨壓和滲透脅迫相關。依據CsP5CS氨基酸序列構建系統進化樹分析表明，單子葉植物與雙子葉植物各聚為一大類，CsP5CS與美味獼猴桃、中華獼猴桃、蠟燭果、煙草、多裂水茄、馬鈴薯、蕃茄、黃瓜聚為一小類，與中華獼猴桃和美味獼猴桃親緣關系最近，推測由同一祖先經不同的途徑進化而來。分子系統樹的分析結果與傳統形態學的分類結果基本吻合，基本上可反映這一組物種的親緣關系規律。以上結果表明，CsP5CS為△1-吡咯琳-5-羧酸合成酶基因，在茶樹鐵觀音脯氨酸生物合成的谷氨酸途徑中起到重要作用。

通過實時熒光定量PCR，對干旱、高鹽脅迫處理下的茶樹鐵觀音的CsP5CS表達情況分析表明：（1）CsP5CS在脅迫誘導下都呈現上調表達。與報道的大豆[24]、菜豆[25]、羅布麻[26]、甘蔗[27]中P5CS表達特性相同，進一步說明茶樹鐵觀音體內存在著滲透脅迫后脯氨酸積累的適應機制，脯氨酸代謝受CsP5CS基因轉錄和翻譯水平的調控。這為進一步研究茶樹鐵觀音體內該基因在滲透脅迫下的生理功能及作用機理奠定了基礎。（2）在干旱脅迫處理期間，葉片組織中CsP5CS基因在0～24 h之內出現較明顯的上調表達，24 h達最高峰，相對表達量為對照組的2.6倍，24 h后出現下調表達，直到72 h降為最低。說明在干旱脅迫處理下，茶樹鐵觀音通過CsP5CS基因的上調表達適應干旱，當處理時間超過72 h，可能已超過植物耐受范圍。在高鹽脅迫處理期間，葉片組織中CsP5CS基因于24～48 h才出現較明顯的上調表達，72 h達最高峰，相對表達量為對照組的9.9倍。Igarashi等[27]研究顯示，水稻OsP5CS基因在干旱脅迫、高鹽脅迫、ABA處理下都出現上調表達。干旱脅迫處理期間，水稻OsP5CS基因于0～5 h內出現上調表達，10 h達最大，之后出現下調表達。高鹽脅迫處理期間，水稻OsP5CS基因于0～24 h內出現上調表達，24 h達最大。Yoshiba等[28]研究顯示，擬南芥AtP5CS基因在干旱、高鹽脅迫處理下也出現類似的表達特性。與本研究的結果一致，可以推測CsP5CS基因是茶樹鐵觀音響應滲透脅迫應答基因之一，茶樹鐵觀音CsP5CS基因對兩種脅迫的應答速度不同，干旱脅迫處理下的應答速度較高鹽脅迫下的應答速度快，且干旱脅迫處理下CsP5CS基因相對表達量較高鹽脅迫處理下低。茶樹鐵觀音對干旱脅迫比高鹽脅迫敏感，對高鹽脅迫處理下的適應能力較干旱脅迫處理下的適應能力強。該結果可能與茶樹的品種或者特有的生理特性有關，對提高茶樹抗逆性具有重大意義。

本研究利用同源克隆首次從茶樹鐵觀音中克隆得到了CsP5CS，為茶樹鐵觀音脯氨酸合成酶系基因的系統研究以及通過分子生物學技術提高茶樹鐵觀音的抗逆性提供了線索。實時熒光定量PCR分析，CsP5CS在干旱、高鹽脅迫條件均上調表達，干旱脅迫下應答速度快，高鹽脅迫下相對表達量高。這些結果可能與茶樹品種或者特有的生理特性有關，具有進一步的研究價值。后期將結合RNA-seq相關數據，在全轉錄本水平對茶樹鐵觀音在不同脅迫下的表達特性進行探討。

參考文獻

[1] Jime'nez-Bremont J F， Becerra-flora A， Herna'ndez-Lucero E， et al. Proline accumulation in two bean cultivars under salt stress and the effect of polyamines and ornithine[J]. J Biol Plant， 2006， 50（4）： 763.

[2] Tripathi S B， Gurumurthi K， Panigrahi A K， et al. Salinity induced changes in proline and betaine contents and synthesis in two aquatic macrophytes differing in salt tolerance[J]. J Biol Plant， 2007， 51（1）： 110.

[3] 焦 蓉， 劉好寶， 劉貫山， 等. 論脯氨酸累積和植物抗滲透脅迫[J]. 中國農學通報， 2011， 27（7）： 216-221.

[4] Zhang C S， Lu Q， Verma D P S. Removal of feedback inhibition of △1-pyrroline-5-carboxylate synthetase， a bifunctional enzyme the first two steps of praline biosynthesis in plants[J]. J Biol Chem， 1995， 270： 20 491-204 966.

[5] 許詳明， 葉和春， 李國鳳. 脯氨酸代謝與植物搞滲透脅迫的研究進展[J]. 植物學通報， 2000， 17（6）： 536-542.

[6] Hong Z L， Lakkineni K， Zhang Z H， et al. Removal of feedback inhibition of △1-pyrroline-5-carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protection of plants from osmotic stress[J]. Plant Physiol， 2000， 122： 1 129-1 136.

[7] Zhu B， Su J， Chang M， et al. Overexpression of △1-pyrroline-5-carboxylate synthetase gene and analysis of tolerance to water and salt stress in transgenicrice[J]. Plant Sci， 1998， 139： 41-48.

[8] Zhang C S， Lu Q， Verma D D S. Removal of feedback inhibition of DELTA-1-Pyrroline-5-carbosylatesynthetase， a bifunctional enzyme catalyzing the first two steps of proline biosynthesis in plants[J]. J of Biol Chem， 1995， 270（35）： 20 491-20 496.

[9] Anoop N， Gupta A K. Transgenic indica rice cv IR-50 over-expressing vigna aconitifolia△1-pyrroline-5-carboxylate synthetase cDNA shows toleranceto highsalt[J]. Plant Biochem. Biotechnol， 2003， 12： 109-116.

[10] Su J， Wu R. Stress-inducible synthesis of praline in transgenic rice confers faster growth under stress conditions than that with constitutive synthesis[J]. Plant Sci， 2004， 166： 941-948.

[11] Molinari， H B C. Osmotic adjustmen in transgenic citrus rootstock Carrizocitrange（Citrus sinensis Osb. Poncirustrifoliate L. Raf.）overproducing proline[J]. Plant Sci， 2004， 167： 1 375-1 381.

[12] Larosa P C， Rhodes D， Rhodes J C， et al. Elevated accumulation of proline in NaCl-adppted tobacco cells is not due to altered 1-pyrroline-5-carboxylate reductase[J]. Plant Physiol， 1991， 96： 245-250.

[13] De Ronde， J A Cress， W A Kruger， et al. Phytosynthetic response of transgenic soybean plants， containing an Arabidopsis P5VR gene， during heat and drought stress[J]. J PlantPhysiol， 2004， 161： 1 211-1 224.

[14] 王守生. 茶樹游離脯氨酸含量及水分脅迫對其影響[J]. 茶葉， 1995， 1： 22-25.

[15] 吳伯千， 潘根生. 茶樹對水分脅迫的生理生化反應[J]. 浙江農業大學學報， 1995， 21（5）： 451-456.

[16] Handique A C. 抗旱茶樹選種指標（許寧譯）[J]. 茶葉科學簡報， 1991， 3： 34 -36.

[17] 伍炳華， 韓文炎， 姚國坤. 茶樹對土壤干旱的生理反應[J]. 中國茶葉， 1991， 6： 2-3.

[18] 李華鈞. 滲透脅迫對茶樹幼苗葉片脯氨酸累積和水分含量的影響[J]. 西南農業大學學報， 1993， 8： 119-122.

[19] 李金昌. 旱熱季節不同嗩水培對秋茶產量和品質的影響[J]. 中國茶葉， 1987， 5： 2-4.

[20] 潘根生. 茶樹新梢生育的內源激素水平及其調控機理（第三報）[J]. 茶葉2001， 27（1）： 35-38.

[21] 潘根生， 吳伯千， 沈生榮， 等. 水分脅迫過程中茶樹新梢內源激素水平的增長及其耐旱性的關系[J]. 中國農業科學， 1996， 29（5）： 9-15.

[22] 史成穎， 宛曉春， 江昌俊， 等. 提取高質量茶樹總RNA的方法研究[J]. 安徽農業大學學報， 2007， 34（3）： 360-363.

[23] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression date using Real-Time quantitative PCR and the 2-△△CT Method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 401-408.

[24] 張春寶， 趙洪錕， 丁福章， 等. 野生大豆△1-吡咯琳-5-羧酸合成酶基因（P5CS）基因的克隆與序列分析[J]. 大豆科學， 2008， 27（6）： 915-919.

[25] 陳吉寶， 趙麗英， 毛新國， 等. 轉PvP5CS1基因擬南芥植株對干旱和鹽脅迫的反應[J]. 作物學報， 2010， 36（1）： 147-153.

[26] 郭 旭. 羅布麻、胡楊P5CS基因的克隆及其功能初步分析[D]. 中國優秀碩士學位論文全文數據庫， 2007， （05）.

[27] 張積森， 陳由強， 張木清， 等. 甘蔗△1-吡咯琳-5-羧酸合成酶基因（P5CS）基因的克隆及其表達分析[J]. 熱帶作物學報， 2009， 30（9）： 1 337-1 344.

[28] Igarashi Y， Yoshika Y， Sanada Y， et al. Characterization of the gene for delta1-pyrroline-5-carboxylate synthetase and correlation between the expression of the gene and salt tolerance in Oryza sativa L[J]. Plant Mol Biol， 1997， 33： 857-865.

[29] Yoshiba Y， Kiyosue T， Katagiri T， et al. Correlation between the induction of gene for △1-pyrroline-5-carboxylate synthetase and the accumulation of praline in Arabidopsis thaliana under osmotic stress[J]. Plant， 1995， 7： 751-760.