西瓜枯萎病菌T—DNA插入轉化子庫的構建及其質量評價

裴月令　曾凡云　彭軍　龍海波　郭建榮

摘 要 為研究西瓜枯萎病菌的致病分子機理，開展了病原菌的轉化子庫構建工作。采用攜帶潮霉素抗性pTFCM雙元載體的農桿菌AGL-1介導的ATMT轉化方法，獲得菌株FON-01的轉化子，通過表型觀察篩選突變體。結果表明：當乙酰丁香酮（AS）濃度為200 μmol/L、農桿菌OD600為0.4、分生孢子濃度為1×106個/mL時，于28 ℃共培養48 h轉化效率高達（663.33±24.95）個/106個孢子。構建了總數為3 832個的轉化子庫并對其進行了質量評價，從2 201個轉化子中篩選出菌落形態、生長速度及產孢量等方面有所變異的突變體73個。病原菌轉化子庫的構建為進一步開展致病分子機理及相關基因克隆等方面研究奠定基礎。

關鍵詞 西瓜枯萎病菌；ATMT；轉化子庫

中圖分類號 S432.1 文獻標識碼 A

Generation of a Transformant Library of Fusarium oxysporum.

f. sp. niveum by ATMT and Its Quality Assessment

PEI Yueling，ZENG Fanyun，PENG Jun，LONG Haibo，GUO Jianrong﹡

Environment and Plant Protection Institute，CATAS/Key Laboratory of Integrated Pest Management on

Tropical Crops，Ministry of Agriculture/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical

Agricultural Pests，Haikou，Hainan 571101， China

Abstract In order to study the pathogenic molecular mechanism of Fusarium oxysporum. f. sp. Niveum，the transformant library was conducted. Agrobacterium strainAGL-1 containing the binary vector pTFCM was used for the transformation of strain FON-01，and the mutants were screened by penotype observation. Transformation efficiency was（663.33±24.95），when the acetosyringone concentration was 200 μmol/L，OD600 of AGL-1 was 0.4，conidia concehntration was 106/mL，co-culture time was 48 h and co-culture temperature was 28 ℃. 3 832 transformants were obtained and quality assessment to the library was finished. 73 mutants with variation of colony shape，growth speed and sporulation ability were screened from 2 201 transformants. The construction of transformants library would provide the foundation for further study of pathogenic molecular mechanism and related genescloning.

Key words Fusarium oxysporum. f. sp. niveum；ATMT；Transformant library

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.013

西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum & Nakai]是中國重要的水果之一，在中國農業經濟中占有重要地位。中國是西瓜生產和消費大國，種植面積和產量均占世界一半以上（FAO）。與其它瓜菜類作物相比，種植西瓜的經濟效益非常高，已經成為增加農戶經濟收入的重要途徑。由尖孢鐮刀菌西瓜專化型[Fusarium oxyxporum Schl. f. sp. niveum（E. F. Smith）Snyder et Hansen]引起的西瓜枯萎病是一種世界性土傳病害，是中國西瓜種植業中的重要病害，生產上防治困難，可造成30%以上的產量損失[1]。

隨著農業經濟的發展，中國的西瓜種植業也呈現設施化、基地化、專業化的發展趨勢，重茬現象非常普遍，為西瓜枯萎病的發生、發展和流行創造了極為有利的條件，導致該病嚴重發生。近年來，該病在中國各個西瓜種植區均有發生，一般病株率10%～20%，重者達80%～90%[2]，已經成為制約西瓜產業發展的主要因素之一。目前有關該病病原菌致病分子機理方面的研究還很少，嚴重制約了相關防控工作的進展。

國內鄭肖蘭等[3]和梁慎等[4]開展了病原菌轉化方法的探索工作，獲得了部分轉化子，但缺少轉化條件的優化和相應的分子鑒定等工作。國外還未見有關利用農桿菌介導該菌遺傳轉化的報道。本研究對根癌農桿菌介導的T-DNA的轉化條件進行優化，建立了西瓜枯萎病菌1號小種的轉化子庫，并對其進行質量評價和突變體篩選工作，為進一步克隆致病相關基因和致病分子機理的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 西瓜枯萎病菌1號小種菌株FON-01由國家蔬菜工程技術研究中心許勇研究員惠贈。攜帶雙元載體pTFCM（Kanr，含PtrpC：：hphB）的農桿菌AGL-1由華中農業大學姜道宏教授惠贈。

1.1.2 培養基及試劑 PDA和LB培養基分別用于培養西瓜枯萎病菌和AGL-1，配方參照《植病研究方法》[5]。MM和IM培養基均用于培養AGL-1，配方參照蔡志英等[6]。

乙酰丁香酮（AS）、2（N-馬啉）乙基磺酸（MES）、頭孢霉素、硫酸鏈霉素、利福平、卡那霉素等產品均購自Sigma公司；潮霉素B購自Roche公司；DNA片段膠回收試劑盒、pMD18-T載體和隨機引物標記試劑盒購買自寶生物工程（大連）有限公司；Taq酶和dNTPs購買自天根生化科技（北京）有限公司；引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 FON-01轉化條件的優化 菌株對抗生素的敏感性測定：將FON-01分別接種于含有不同濃度潮霉素的PDA平板上，觀察其生長情況并評價其敏感性。

FON-01分生孢子液的制備：將菌株接種于液體PDA培養基上，以180 r/min、28 ℃培養5 d，用IM液體培養基調至所需濃度。

FON-01的轉化： （1）將AGL-1（攜帶pTFCM）菌株在LB培養基平板（含50 mg/L利福平，50 mg/L卡那霉素）上劃線，于28 ℃培養2 d。（2）挑取單菌落接種于10 mL MM培養基（含50 mg/L卡那霉素）上，以180 r/min，28 ℃培養2 d。（3）離心收集菌體，用IM培養基（含適量 AS）以 180 r/min、28 ℃培養5～6 h，用IM培養基將菌液OD600稀釋至所需濃度，與FON-01孢子液按照1 ∶ 1（V ∶V）比例混合。（4）取0.2 mL混合液涂布于鋪有硝酸纖維素膜的IM 平板上（含200 μmol/L的AS，直徑9 cm），避光共培養后，用滅菌的手術刀將硝酸纖維濾膜切成寬度約為5 mm的條帶，分別反鋪于2個PDA平板上（含250 mg/L潮霉素、250 mg/L頭孢霉素），于28 ℃培養5 d后將濾膜邊緣的單菌落轉接到PDA平板上（含250 mg/L潮霉素）進行復篩并保存，統計各處理轉化子數并計算轉化效率。其中AS濃度設為50、100、150、200、250、300、350 μmol/L，AGL-1（pTFCM）OD600值設為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，FON-01孢子液濃度設為1×104、1×105、1×106、1×107、1×108個/mL，共培養時間和溫度分別設為24、36、48、60、72 h和16、24、26、28、30、32 ℃等。每處理5個平板，重復3次，計算平均數和標準差，并用SAS9.0軟件進行差異顯著性分析[7]。

1.2.2 FON-01轉化子庫的構建和質量評價 參照1.2.1中優化后的轉化條件，進行轉化子庫的構建并對其進行質量評價。遺傳穩定性評價：隨機選取20個轉化子接種于PDA平板，以28 ℃培養5 d后在菌落邊緣挑取少量菌絲接種到一個新的PDA平板上，轉接10次后接種到含250 mg/L潮霉素的PDA平板上，觀察菌落生長情況。

PCR擴增：根據載體pTFCM潮霉素抗性基因編碼區設計引物Hygst1（5′-TGAACTCACCGCGACGT

CTGT-3′）和Hygst2（5′-ACGGTGTCGTCCATCACAGT

-3′），2引物之間長度為498 nt。參照Xu等[8]的方法提取FON-01和20個轉化子基因組DNA并進行PCR擴增，以無菌水為對照，將擴增產物克隆后進行測序驗證。

Southern雜交驗證：隨機選取14個轉化子，提取基因組DNA后，選用在載體pTFCM上沒有識別位點的ApaⅠ進行充分酶切。以AGL-1（攜帶pTFCM）菌液為模板，用引物Hygst1和Hygst2進行PCR擴增，將產物回收、定量后參照曾凡云[9]的方法按照試劑盒說明書進行探針標記和Southern印跡雜交。

1.2.3 突變體的篩選 將FON-01和轉化子分別接種于PDA平板中央（直徑9 cm），于28 ℃培養7 d后觀察菌落形態，采用十字交叉法測量菌落直徑。待菌落長滿整個PDA平板（直徑9 cm）時，用10 mL無菌水將菌落表面的分生孢子洗下，鏡檢計數。每個轉化子5個平板，重復3次并進行SAS分析[7]。

2 結果與分析

2.1 FON-01轉化條件的優化

培養結果表明，當潮霉素濃度在250 mg/L以上時，菌株FON-01的生長完全受到抑制，因此在建庫時用含有該濃度潮霉素的PDA平板進行轉化子的篩選。

經過多次轉化試驗，發現用AS預處理AGL-1（攜帶pTFCM）時，當AS濃度在50 μmol/L時僅出現個別單菌落，AS濃度越高轉化效率越高。當AS濃度為200 μmol/L時，轉化效率為（620.67±20.98）個/106個孢子，平均每個平板上出現31.04個轉化子（圖1-A）。由于高濃度的AS會增加T-DNA片段插入的拷貝數，另外轉化效率太高不利于生長缺陷突變體的挑取，因此選用200 μmol/L的AS進行轉化。進一步的研究表明，AS濃度為200 μmol/L、農桿菌OD600為0.4、分生孢子濃度為1×106 個/mL時，于28 ℃共培養48 h轉化效率最高，為（663.33±24.95）個/106個孢子（圖1B-E）。

2.2 FON-01轉化子庫的構建和質量評價

參照2.1中轉化條件的優化結果進行轉化子庫的構建，目前已獲得3 832個轉化子。

2.2.1 遺傳穩定性評價 選取的20個轉化子在不含潮霉素的PDA 平板上轉接10次后再轉接到含潮霉素的PDA 平板，均能正常生長，其菌落形態與初始培養物無明顯差別，表明轉化子所攜帶的外源片段能夠穩定遺傳。

2.2.2 PCR擴增 以FON-01和轉化子的基因組DNA為模板，用引物Hygst1和Hygst2進行PCR擴增，結果20個轉化子均獲得約0.5 kb的擴增產物（圖2）。隨機選取轉化子Fat38、Fat188和Fat648的擴增產物并進行回收、克隆后測序， 結果表明其和潮霉素抗性基因編碼區序列完全一致。

2.2.3 Southern雜交驗證 隨機選取14個轉化子進行southern雜交，結果轉化子Fat38、Fat188、Fat648、Fat1420、 Fat1937、Fat2678、Fat2816和Fat3131均有1條信號帶，轉化子Fat849、Fat1287、Fat2897和Fat3428均有2條信號帶，而Fat1348和Fat1672分別有3條和4條信號帶（圖3）。

2.3 突變體的篩選

通過菌落形態觀察和產孢量統計，從2 201個轉化子中初步篩選出菌落形態、生長速度及產孢量等方面有所變異的突變體73個，其中菌落形態、生長速度和產孢量均變異的有8個，菌落形態和生長速度變異的有1個，生長速度和產孢量變異的有41個，僅菌落形態變異的有3個，僅生長速度變異的有9個，僅產孢量變異的有11個（表1和圖4）。

3 討論與結論

本研究利用攜帶雙元載體pTFCM的農桿菌菌株AGL-1介導的遺傳轉化方法構建了總數為3 832個的西瓜枯萎病菌轉化子庫并對其進行了質量評價。從14個轉化子的Southern雜交結果發現其中8個轉化子只有一條信號帶，估算單位點插入轉化子比例約為57.14%。在對2 201個轉化子的初步篩選中獲得了在菌落形態、生長速度及產孢量等方面有所變異的突變體73個。該病原菌轉化子庫的構建及部分突變體的獲得，為進一步開展致病分子機理和相關基因克隆等研究奠定基礎。

通過基因插入失活獲得覆蓋整個基因組的轉化子庫，從中篩選表型變異突變體，并利用外源插入片段作標記進行目的基因的克隆是當前功能基因組學研究的常用策略。限制性內切酶介導的REMI和農桿菌介導的ATMT是最常用的絲狀真菌轉化技術。和REMI技術相比，ATMT具有轉化材料易得[10]、效率高[11-12]、外源片段插入比例高且多為單位點[13]以及轉化子遺傳穩定等優勢[14-15]。1995年，Bundock等[16]首次采用該技術完成釀酒酵母的轉化，隨后該技術在曲霉[17]、稻瘟菌[18]、炭疽菌[19]等真菌轉化中得到廣泛應用。本研究也成功地利用該方法構建了西瓜枯萎病菌的轉化子庫。

研究表明，ATMT的轉化效率受受體菌菌株[11]、農桿菌菌株及轉化載體[20]等方面因素的影響。本研究發現當農桿菌OD600為0.4、分生孢子濃度為1×106個/mL，于28 ℃共培養48 h時轉化效率最高，當AS濃度為200 μmol/L時，轉化效率高達（663.33±24.95）個/106孢子，顯著優于鄭肖蘭等[3]和梁慎等[4]的研究結果。鄭肖蘭等[3]的研究表明分生孢子濃度以（0.1～5.0）×106個/mL為宜，與本研究并不一致；另外，鄭肖蘭等[3]和梁慎等[4]所選用的雙元載體、病原菌菌株以及菌株對潮霉素的抗性均與本研究不同，這可能是導致研究結果不同的原因之一。

絲狀真菌中，單個基因的缺失常造成多個表型的變異。Hou等[21]發現MAPK途徑中的MGV1基因缺失后，合谷鐮刀菌的產孢量、育性以及侵染小麥的能力均發生了變異。Yang等[22]克隆到稻瘟菌致病相關基因Com1，該基因缺失后孢子形態發生變異，附著胞膨壓下降并且喪失了致病性。西瓜枯萎病是一種土傳病害，病原菌主要從根部侵入，破壞微管組織，然后造成植株萎蔫并最終死亡。病原菌致病相關突變體的篩選需要大量的人工接種試驗，限制了致病性相關突變體的大規模篩選工作。本研究通過對轉化子的表型觀察和產孢能力評估，初步獲得了73個突變體，但相關的缺失基因是否和病原菌的致病性相關，還需要開展進一步的研究。

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