增強UV—B輻射對2個烤煙品種生理代謝指標的影響

邵建平　楊志新　何承剛　王燕霞　胡德波

摘 要 在大田栽培和自然條件下，研究人工模擬2種UV-B輻射（308 nm，1.83 kJ/m2，1.06 kJ/m2）對烤煙紅花大金元品種和云煙87品種葉片光合色素、酶活性及4種代謝產物積累的影響。結果表明：增強UV-B輻射可減少紅花大金元葉片光合色素含量，降低過氧化物酶（POD）的活性，增強過氧化氫酶（CAT）和硝酸還原酶（NR）的活性，促進可溶性蛋白質（SP）和丙二醛（MDA）的積累；UV-B強度較低時可增強其超氧化物歧化酶（SOD）和多酚氧化酶（PPO）的活性，促進紫外吸收物質的積累。對于云煙87來說，增強UV-B輻射可增加其光合色素含量，增強3種抗氧化酶和NR酶的活性，促進SP的積累，降低紫外吸收物質的含量；低強度的UV-B輻射可增強PPO的活性，顯著提高MDA和SP的含量。

關鍵詞 烤煙；UV-B輻射；光合色素；酶活性；代謝產物

中圖分類號 S572 文獻標識碼 A

Effect of Enhanced Ultraviolet-B on the Indices of Main Physiological Metabolism of Two Flue-cured Tobacco Varieties

SHAO Jianping1， YANG Zhixin2*， HE Chenggang3， WANG Yanxia1， HU Debo4

1 Qujing City Branch Luoping Tobacco Company， Luoping， Yunnan 655800， China

2 College of Resources and Environment， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China

3 College of Tobacco Science， Yunnan Agircultural University， Kunming， Yunnan 650201， China

4 Zhaotong Soil and Fertilizer Station， Zhaotong， Yunnan 657000， China

Abstract Field experiments were conducted to study the effect of enhanced ultraviolet-B（UV-B，308 nm，1.83 kJ/m2 and 1.06 kJ/m2， respectively）radiation on the content of photosynthetic pigments， enzyme activity and the accumulates of four metabolic products of two flue-cured tobacco cultivars（Hongda and Yunyan87） under natural light conditions. The results showed that enhanced ultraviolet-B radiation could reduce the photosynthetic pigment content of Hongda， reduce peroxidase（POD） activity， enhance the catalase（CAT）and nitrate reductase（NR）activity， promote the accumulation of protein and malondialdehyde content（MDA）. Low-intensity ultraviolet-B radiation could enhance superoxide dismutase（SOD） and polyphenol oxidase（PPO） activity and promote the accumulation of UV-absorbing compounds. As for Yunyan 87， enhanced ultraviolet-B radiation could increase the content of photosynthetic pigments， enhance the three kinds of antioxidant enzymes and NR activity， promote the accumulation of pro and reduce the content of UV-absorbing compounds. Low-intensity ultraviolet-B radiation could enhance the PPO activity of Yunyan 87， significantly enhanced the content of pro and MDA.

Key words Flue-cured tobacco；UV-B radiation；Photosynthetic pigments；Enzyme activity；Metabolic product

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.022

云南是中國優質煙葉產區，平均海拔2 000 m左右，紫外輻射強度隨海拔高度的增加呈規律性遞增[1]。在UV-B的輻射下，許多敏感植物的生長和生物量累積都有明顯的降低[2]，這說明植物的光合作用受到了抑制。已有研結果表明，UV-B增加導致光合作用受阻，主要包括光損傷、光抑制、光氧化3個方面，類胡蘿卜素在植物光合作用中擔負著光吸收輔助色素的重要功能，具有吸收和傳遞電子的能力，可清除紫外脅迫下光合作用中產生的葉綠素三線態、單線態及超氧陰離子等自由基[3-4]，對植物有重要的保護作用。一般認為，UV-B脅迫通常導致植物體內活性氧代謝發生紊亂，從而造成機體受到的活性氧損傷加重，膜系統被破壞，影響一系列的生理代謝過程[5]。

Barbato等[6]研究結果表明，增強的UV-B輻射將會對蛋白質產生較大影響。龍蕓等[7]研究結果表明，紫外線處理后，前25 min煙草葉片中的可溶性蛋白含量增加，其后可溶性蛋白含量逐步下降；葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量（a+b）、葉綠素a/b和類胡蘿卜素含量均呈上升趨勢。另一方面，植物可通過酶類或非酶類抗氧化系統清除植物體內由于UV-B輻射而產生的過多的活性氧。CAT、SOD和POD是酶類抗氧化系統中3類重要的酶。這些抗氧化酶對于及時清除活性氧、保持膜系統的完整性非常重要[8]。Santos等[9]和強維亞等[10]的研究結果表明，UV-B輻射會引起馬鈴薯和大豆葉片中的POD活性明顯增強。吳杏春等[11]證明了UV-B輻射脅迫使水稻葉片SOD、CAT活性先升后降，POD活性上升。李惠梅等[12]以青藏高原的特有植物麻花艽為材料，研究增強UV-B輻射對其抗氧化酶系統的影響，結果表明，在UV-B處理初期，麻花艽葉片中SOD、POD的活性都能增加，但隨著處理時間的延長，SOD、POD的活性均呈下降趨勢，CAT的活性在UV-B處理后下降明顯。劉蕓等[13]觀察到增強UV-B輻射引起括樓幼苗葉綠素含量明顯下降，細胞膜相對透性顯著增加，SOD、POD、CAT活性急劇下降。

烤煙中的品質成分主要依賴于烤煙生長季節中積累的各種代謝產物的含量及協調程度，因此，了解幾種主要代謝產物對煙葉品質構成中的作用顯得尤為重要。本研究通過人工模擬增強UV-B輻射，利用紫外線強度分析儀測量UV-B輻射強度，研究探討UV-B輻射對云煙87和紅花大金元光合色素、酶活性及代謝產物的影響，分析云煙87和紅花大金元對UV-B輻射的適應性，為烤煙生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗地概況

以烤煙品種云煙87（Yunyan 87）和紅花大金元（Hongda）為試驗材料，包衣種子，漂浮育苗。云南農業大學位于云南省昆明市，介于東經102°10′～103°40′、北緯24°23′～26°22′之間。該地屬低緯高原山地季風氣候，大部分地區海拔在1 500～2 800 m，年平均氣溫為14.5 ℃，年平均降水量為1 035 mm，相對濕度為74%，且降雪年份極少。由于溫濕度適宜，日照長，霜期短，雨量充沛，適宜煙草生長。煙草大田主要生長期（5～8月）正值云南地區的雨季，該時段降雨量占全年降雨量的63.7%。試驗于2013年在云南農業大學后山農場進行，北緯25°，海拔1 950 m，試驗地為菜地，紅壤，試驗前土壤理化性質：有機質34.07 mg/kg、pH6.43、堿解氮203.38 mg/kg、速效磷19.28 mg/kg、速效鉀166.83 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗采用隨機區組設計，設2個因素；A因素為品種，設2個水平，H：紅花大金元，Y：云煙87；B因素為U-VB輻射強度，設3個水平，CK：0（自然光照射），L：1.06 kJ/m2，H：1.83 kJ/m2，因此有HCK、HL、HH、YCK、YL、YH共6個處理，3次重復，共18個小區，小區面積為22.5 m2，煙株種植規格為1.2 m×0.5 m，試驗區四周開邊溝并設置保護行。

采用在煙株頂端吊掛40WUV-B燈管（308 nm，北京光電儀器廠）的方法進行人工模擬增強UV-B輻射，利用紫外線強度分析儀（北京師范大學儀器廠）測量UV-B輻射強度（以煙株頂端記）。自團棵期開始至煙葉采收結束，每天10 a. m.～17 p. m.（陰雨天除外）時進行UV-B照射，照射時間為7 h/d。其中模擬的2個UV-B輻射水平1.06 kJ/m2和1.83 kJ/m2分別相當于昆明地區（北緯25°，海拔1 950 m）約4.2%和7.3%的臭氧衰減。

云煙87以純氮量105 kg/hm施肥，紅花大金元按純氮量52.5 kg/hm施肥，N ∶ P ∶ K為1 ∶ 1 ∶ 3。試驗的各項生產技術統一按照昆明市一般烤煙生產田的生產要求執行。

1.2.2 測定項目和方法 光合色素含量的測定：煙株自上而下有效葉片第4葉，距葉尖1/3、離主脈1 cm處取樣，采用直接浸提法[14]測定，浸提液采用10 mL乙醇（95%）-丙酮（80%）混合液（V ∶ V=1 ∶ 1）。

酶活性的測定：煙株自上而下有效葉片第2葉，距葉尖1/3、離主脈1 cm處取樣，采用愈創木酚氧化法[15-16]測定POD的活性；采用氮藍四唑（NBT）光還原法[7-8]測定CAT的活性；采用愈創木酚氧化法[15-16]測定SOD的活性；采用鄰苯二酚氧化法[10]測定PPO的活性；采用活體法[14，16-17]測定NR的活性。

代謝產物的測定：煙株自上而下有效葉片第2葉，距葉尖1/3、離主脈1 cm處取樣。采用考馬斯亮藍G-250法[17]測定水溶性蛋白質；采用硫代巴比妥酸反應法[16]測定MDA的含量；采用茚三酮顯色法[16]測定游離脯氨酸（Pro）的含量；采用酸化甲醇（甲醇 ∶ 蒸餾水 ∶ 鹽酸=79 ∶ 20 ∶ 1）提取法[17]測定紫外吸收物質。

1.3 數據處理

采用SPSS 13.0數據分析軟件和Microsoft Excel 2003進行數據處理與統計分析。

2 結果與分析

2.1 增強UV-B輻射對紅花大金元和云煙87葉片光合色素含量的影響

由圖1可知，紅花大金元經2種強度UV-B輻射后，其葉綠素a含量顯著下降，1.06 kJ/m2的UV-B處理下降幅度最大，三者關系為：對照>強度為1.83 kJ/m2的UV-B處理>1.06 kJ/m2的UV-B處理，差異達顯著水平（p<0.05）。葉綠素b含量為1.06 kJ/m2的UV-B處理與對照無顯著差異，但強度為1.83 kJ/m2的UV-B處理后，其含量顯著下降（p<0.05）。類胡蘿卜素含量在強度為1.06 kJ/m2的UV-B處理后顯著下降（p<0.05），而1.83 kJ/m2的UV-B處理有上升與且對照無顯著差異。

由圖2可知，云煙87葉綠素a和葉綠素b含量均隨UV-B輻射的增強而顯著升高（p<0.05），葉綠素a與葉綠素b分別與UV-B輻射強度呈極顯著正相關（r=0.943**、r=0.938**）。三者在類胡蘿卜素含量方面無顯著差異。

2.2 增強UV-B輻射對紅花大金元和云煙87葉片主要酶活性的影響

由表1可知，紅花大金元煙葉中，2種強度UV-B輻射均可降低POD的活性，尤以強度為1.06 kJ/m2的UV-B處理下降幅度最大，三者關系為：對照>強度為1.83 kJ/m2的UV-B處理>1.06 kJ/m2的UV-B處理，三者之間的差異達到極顯著水平（p<0.01）。CAT和NR活性隨UV-B輻射的增強而極顯著增強（p<0.01），這2種酶與UV-B輻射強度分別呈極顯著正相關（r=0.947**、r=0.943**）。SOD活性在強度為1.06 kJ/m2的UV-B處理后降低，強度為1.83 kJ/m2的UV-B處理后增強，三者關系為：1.83 kJ/m2的UV-B處理>對照>1.06 kJ/m2的UV-B處理，其間差異達到極顯著水平（p<0.01）。2種強度UV-B輻射均可增強PPO活性，且以1.06 kJ/m2的UV-B處理增強幅度最大，三者關系為：1.06 kJ/m2的UV-B處理>強度為1.83 kJ/m2的UV-B處理>對照，其間差異達到極顯著水平（p<0.01）。

云煙87的POD、CAT和SOD活性均隨UV-B輻射的增強逐漸增強，三者與UV-B輻射強度分別呈極顯著正相關（r=0.904**、r=0.960**、r=0.903**），且POD和SOD活性在3個處理間差異達0.05顯著水平，CAT活性在3個處理間差異達0.01顯著水平。PPO活性在強度為1.06 kJ/m2的UV-B處理后，活性極顯著增強（p<0.01），而經1.83 kJ/m2的UV-B處理后，活性與對照無顯著差異。另外，2種強度UV-B輻射處理可增強NR的活性，尤以強度為1.06**的UV-B處理增強幅度最大，3個處理NR活性的關系為：1.06**的UV-B處理>1.83**的UV-B處理>對照，差異達極顯著水平（p<0.01）。

2.3 增強UV-B輻射對紅花大金元和云煙87葉片4種代謝產物含量的影響

由表2可知，紅花大金元葉片中SP含量隨UV-B輻射的增強，其含量升高，差異達極顯著水平（p<0.01），二者呈極顯著正相關（r=0.993**）；Pro含量隨UV-B輻射的增強，其含量逐漸減少，差異極顯著（p<0.01），二者呈極顯著負相關（r=-0.942**）；MDA含量也隨著UV-B輻射的增強逐漸升高，二者呈極顯著正相關（r=0.785**），但強度為1.06 kJ/m2的UV-B處理和對照之間無顯著差異（p>0.05），此二者與強度為1.83 kJ/m2的UV-B處理之間差異達0.05的顯著水平；紫外吸收物質在強度為1.06 kJ/m2的UV-B處理下顯著升高，當強度為1.83 kJ/m2的UV-B處理后，又下降到與對照相近水平，強度為1.06 kJ/m2的UV-B處理顯著高于1.83 kJ/m2的UV-B處理和對照（p<0.05）。

云煙87葉片中SP含量隨UV-B輻射的增強，其含量升高，差異達極顯著水平（p<0.01），二者呈極顯著正相關（r=0.969**）；Pro含量在強度1.06 kJ/m2的UV-B處理下急劇上升，當強度1.83 kJ/m2的UV-B處理后，又有所下降，三者關系為：1.06 kJ/m2的UV-B處理>強度1.83 kJ/m2的UV-B處理>對照，差異達極顯著水平（p<0.01）；MDA含量在強度1.06 kJ/m2的UV-B處理下升高，當強度1.83 kJ/m2的UV-B處理后，又急劇下降，三者關系為：1.06 kJ/m2的UV-B處理>對照>強度1.83 kJ/m2的UV-B處理，差異達極顯著水平（p<0.01）；紫外吸收物質含量隨UV-B輻射的增強極顯著降低（p<0.01），二者呈極顯著負相關（r=-0.921**）。

3 討論與結論

增強UV-B輻射會降低紅花大金元葉片內葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量，以1.06 kJ/m2的UV-B輻射葉綠素a和類胡蘿卜素含量降幅最大，而葉綠素b含量則以1.83 kJ/m2的UV-B輻射降幅最大。云煙87的葉綠素a和葉綠素b隨UV-B輻射的增強而升高，它們之間呈顯著正相關，這與劉敏等[18]的研究結果一致，隨著UV-B強度的增加，烤煙為適應這一環境，可能會通過提高葉綠素合成酶活性促進葉綠素的合成，或者通過其它途徑大量合成葉綠素，即葉綠素增加是烤煙適應強烈UV-B輻射的一種途徑。但這一機理有待試驗的進一步研究。類胡蘿卜素則在UV-B輻射的影響下沒有明顯的差異表現。

對于紅花大金元來說，UV-B輻射增強會降低POD的活性，尤以1.06 kJ/m2的UV-B處理降幅最大，而CAT和NR活性則隨UV-B輻射的增強而增強。SOD活性在強度為1.06 kJ/m2的UV-B輻射后降低，而在強度為1.83 kJ/m2的UV-B處理后又急劇增強，呈先降后升的趨勢。另外，UV-B輻射增強會增強PPO活性，尤以1.06 kJ/m2的UV-B處理增加幅度最大。云煙87的3種抗氧化酶活性都隨UV-B輻射的增強逐漸增強，這與前人研究結果[19]相吻合。PPO活性在強度為1.06 kJ/m2的UV-B處理后，活性顯著增強，而經1.83 kJ/m2的UV-B處理后，活性又下降。NR的活性在增強UV-B輻射時增強，尤以強度為1.06 kJ/m2的UV-B處理增強幅度最大。出現上述變化規律的原因可能是較弱的UV-B輻射會提高紅花大金元抗逆性，使葉片細胞中活性氧自由基含量下降，而這些活性氧離子可能會刺激POD和SOD的活性增強，它們的數量一旦減少，則受其刺激而增強活性的POD和SOD活性則會大大降低，所以，在較強的UV-B輻射下，因煙葉細胞內積累了大量的活性氧，抗氧化酶的活性也相應提高了。UV-B輻射的強度只有在一定范圍內，抗氧化酶才會有這種表現。已有研究結果表明[20]，強烈的UV-B輻射能夠引起細胞內活性氧自由基的大量積累，同時又會抑制其SOD、POD和CAT的活性。

紅花大金元和云煙87葉片中SP含量隨UV-B輻射的增強不斷升高，這是UV-B輻射促進煙葉中氮代謝的結果，這種氮代謝的增強就是煙株抵抗輕微UV-B的表現[21]。這一現象同時也驗證了適當強度UV-B輻射可增強煙葉中氮代謝作用。紅花大金元葉片中Pro含量隨UV-B輻射的增強逐漸減少，說明UV-B輻射不利于紅花大金元耐旱性和抗寒性的提高，且隨著UV-B輻射的增強，其耐旱性和抗寒性會愈加減弱。云煙87葉片中Pro經2種強度UV-B輻射處理后，其含量都大幅增加，尤其以強度為1.06 kJ/m2的UV-B處理增加量最大，說明2種強度的UV-B輻射對云煙87有脅迫作用，導致Pro大量積累；另一方面，也可反映出適當強度（尤其較弱強度）UV-B輻射可顯著提高云煙87的抗寒性和耐旱性。云煙87在 UV-B脅迫下Pro積累可能有以下原因：①UV-B輻射降低了Pro DH的活性，阻礙了合成的Pro進一步降解；②UV-B輻射使AtPro DH的轉錄水平減少。至于云煙87葉片在強度為1.83 kJ/m2的UV-B處理下Pro含量又有所下降，可能是因為較強的UV-B輻射加劇了P5C合成酶活性的失活，合成強烈受阻所致。也有的研究結果[22]表明，Pro的積累是UV-B影響下ABA的升高引起的。紅花大金元葉片中MDA含量隨UV-B輻射的增強而逐漸升高，強度1.83 kJ/m2的UV-B處理尤其升高明顯。云煙87在1.06 kJ/m2的UV-B處理后MDA顯著上升，而在1.83 kJ/m2的UV-B處理后又急劇下降。MDA含量上升是煙株葉片受到UV-B脅迫的結果，云煙87在較強的UV-B脅迫下含量反而下降，可能是POD活性在UV-B刺激下劇烈增強所致。紅花大金元在強度1.06 kJ/m2的UV-B處理下葉片內紫外吸收物質含量有所增加，而在強度1.83 kJ/m2的UV-B處理下又有減少趨勢，而云煙87葉片內紫外吸收物質則隨UV-B輻射的增強不斷減少，說明較低強度UV-B輻射可增加較耐UV-B輻射的烤煙品種葉片內紫外吸收物質，而較強的UV-B輻射可抑制烤煙（尤其是對UV-B較為敏感的烤煙品種）葉片中紫外吸收物質的合成和加劇其分解作用。

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