Fusarium mangiferae對杧果酚類代謝的影響

柳鳳　歐雄常　詹儒林　韋繼光　常金梅

摘 要 為探討杧果感染畸形病過程中頂芽內酚類代謝的變化規律，以凱特杧為試驗材料，測定了接種病菌（Fusarium mangiferae）后頂芽內總酚、類黃酮含量及酚類代謝相關酶（POD、PPO和PAL）活性的變化趨勢。結果表明，接種病菌后杧果頂芽內總酚、類黃酮含量出現先上升后下降的變化趨勢，其峰值分別出現在接種病菌45 d和30 d，酚類代謝相關酶中PAL活性變化與總酚含量變化趨勢相同，POD和PPO活性在接種病菌后直線上升。F. mangiferae侵染對杧果酚類代謝產生顯著影響，可干擾杧果頂芽內總酚、類黃酮的含量變化，影響其相關酶活性，降低杧果對病菌的抵抗能力。杧果酚代謝紊亂失衡可能是病菌的重要致病機理之一。

關鍵詞 杧果畸形病；Fusarium mangiferae；侵染；酚類代謝

中圖分類號 S667.7 文獻標識碼 A

Effects of Fusarium mangiferae on Phenolic Metabolism in Mango

LIU Feng1，2， OU Xiongchang1， ZHAN Rulin1， WEI Jiguang2， CHANG Jinmei1

1 South Asia Tropical Crop Research Institute， CATAS， Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture，

Zhanjiang， Guangdong 524091， China

2 Agricultural Colleges， Guangxi University， Nanning， Guangxi 530004， China

Abstract In order to study the effect of pathogens causing malformation on phenolic metabolism in mango， we detected the changes of phenolics and flavonoids contents， peroxidase（POD）， phenylalanine ammonia-lyase（PAL）and polyphenol oxidase（PPO）activities in mango infected by Fusarium mangiferae. The results showed that， total contents of phenolics and flavonoids and activity of phenylalanine ammonia-lyase（PAL）were significantly increased in 45 days after inoculation，then decreased quickly， the activity of polyphenol oxidase（PPO）and peroxidase（POD）did not change obviously at the beginning after inoculation， then increased continuously. The pathogens could affect the phenolic metabolism in mango significantly， which related to its resistance reducing. The phenolic metabolism disturbances may be one of the important reasons about the disease occurs.

Key words Mango malformation； Fusarium mangiferae； Infection； Phenolic metabolism

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.025

酚類是植物抗病反應的主要生化物質，是一類苯環上含有一個或多個羥基的芳香族衍生物，能夠被逆境的生物和非生物因子誘導合成[1-2]。植物體內的酚類物質代謝網是一個錯綜復雜的過程，酚類物質可轉化為醌類和木質素等其他抗性更強的物質，間接提高植物的抗病性[3-4]。許多研究結果表明，酚類代謝在植物與病原生物互作過程中參與許多生理過程，如木質化形成、氧化還原反應、對毒素活性的反應和刺激反應等[5-6]。杧果畸形病是一種危害杧果正常生長的世界性病害，植株感病后嫩葉變細而脆，嫩芽、花序簇生，最后干枯，因此杧果染病后幾乎不座果。國內該病主要分布在云南、四川海拔較高的杧果晚熟地區[7-8]。國內外關于該病的研究主要集中在病原菌的生物學和分子生物學、地理分布、流行學、病原菌侵染寄主過程等方面，而有關病害的致病機理方面研究并不多。有研究報道病組織的形成與病原菌的毒素分泌和杧果內源激素的失調有十分密切的關系[9]，但關于病原菌對杧果酚代謝影響目前還無人探討。本研究以我國杧果晚熟地區主栽品種“凱特”杧為材料，通過比較人工接種F. mangiferae后，健康與接種杧果內酚類代謝的差異，旨在闡明F. mangiferae侵染對杧果酚類代謝的影響，豐富杧果畸形病病理的基礎理論，為進一步研究病害發生的內在機制以及杧果畸形病的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和設計

供試MG06菌株為杧果畸形病病原菌。以健康的一年生凱特杧實生苗為材料，采用組織塊接種法接種。將病菌在PDA培養基上培養7 d后，菌落邊緣打孔，取直徑0.8 cm的菌餅作為接種體。利用解剖刀在頂芽下1～2 cm處刺傷，將菌餅菌絲面貼于刺傷處，保濕培養。每間隔5 d接種1次，共接種5次。接種后0、15、30、45、60、75、90、105 d后取樣。每處理每次取15個芽，在液氮冷凍中磨成粉狀進行混勻，分開包裝后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 杧果體內總酚含量測定 總酚的提取和含量參照林植芳等[10]的方法略作修改，具體如下：取0.5 g杧果頂芽粉狀物，立刻以含1% HCl的甲醇溶液提取，定容10 mL后，280 nm下測定吸光度值，以沒食子酸作標準曲線加以計算，標準曲線y=0.356 2x-0.004 1（R2=0.995 4）。

1.2.2 杧果體內類黃酮含量測定 取2 g頂芽粉狀物，加入20 mL 60%的乙醇，25 kHz、800 W和40 ℃超聲波條件下提取1 h，過濾得濾液，殘渣經超聲波再次浸提，過濾。合并兩次濾液，減壓蒸發濃縮使體積減半，用等量石油醚萃取，去除石油醚部分，將乙醇部分繼續減壓濃縮蒸干后，用10 mL甲醇定容，作為樣品提取液。取1 mL提取液，加入1 mL 1%三氯化鋁甲醇溶液，2 mL甲醇溶液，搖均靜止放置20 min，以甲醇作為空白，于274 nm下測定吸光度值。每個樣品設置3個平行樣。以蘆丁為標準物，具體測定方法同提取液，得到回歸方程為y=0.842 1x-0.005 2（R2=0.988 7）。

1.2.3 杧果體內酚類代謝相關酶活性測定 POD、PAL和PPO活性測定參照張志良、李合生和高俊鳳等[11-13]的方法。

1.2.4 杧果頂芽內主要酚類含量測定

（1）色譜條件。色譜儀為島津（Shimadzu）高效液相色譜儀，包括LC-10ATvp高壓泵，SPD-10Avp檢測器，CTO-10ASvp柱溫箱，C-R8A積分儀；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-0.6%乙酸（50 ∶ 500 ∶ 450）；柱溫35 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量10 μL。流動相為1%冰乙酸水溶液（A液）和乙腈（B液），流速為1 mL/min，梯度洗脫程序：0～20 min（90%～65% A液，10%～35% B液），20～30 min（65% A液，35% B液），30～40 min（65%～90% A液，35%～10% B液），40～45 min（90% A液，10% B液）。

（2）酚含量測定。利用甲醇配制供試9種酚的標準液，適當比例混合后得9種標準品混合液，按上述液相條件進行檢測，采用峰面積外標法定量測定，以濃度為縱坐標，峰面積為橫坐標，計算得到各標樣的曲線方程和相關系數，具體見表1。取樣品總酚提取液2 mL，0.45 μm濾膜過濾后檢測供試9種酚的含量。

1.3 試驗數據的統計分析

數據的處理和分析均采用Microsoft Excel 2003 軟件及SPSS10.0 for Windows統計軟件進行統計分析和Duncans（鄧肯氏）多重差異比較，p<0.05為差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 接種病原菌后杧果畸形病發病情況

將病原菌回接到杧果嫩梢上結果顯示， 45 d之后接種頂芽處形成大量凸起小芽包，75 d后凸起的芽包大量萌發，后期150 d萌發大量新芽，約是空白對照的7～9倍，且新葉細小生長緩慢，與對照相比節間偏短，與典型的枝葉畸形相同（圖1）。

2.2 接種病原菌后杧果體內總酚含量變化測定

杧果正常生長期總酚含量保持在一個穩定水平，約為1.35 mg/g FW。接種病原菌后杧果頂芽內總酚含量呈現先上升后下降的趨勢，如圖2所示。接種病原菌0～15 d內，總酚含量直線上升，15～45 d處于頂峰狀態，約為2.45 mg/g FW，是相同時期對照處理的1.67倍。接種病原菌45 d后，總酚含量急劇降低，60 d后顯著低于對照處理，且隨著接種時間的延長，總酚含量一直處于較低的水平，105 d時其含量僅僅為對照處理的27.2%。

2.3 接種病原菌后杧果體內類黃酮含量測定

病原菌侵染后杧果頂芽內類黃酮的含量與總酚呈現相同的變化趨勢，均為先上升后下降，但類黃酮的峰值出現在接種病原菌30 d時，類黃酮量為0.84 mg/g FW，是對照處理的1.74倍，接種病原菌30 d后其含量不斷降低，接種病原菌90 d后達到最低（圖3）。

2.4 接種病原菌后杧果體內酚類代謝相關酶活性測定

POD可以催化松柏醇等木質素前體的形成以及許多單酚、多酚和芳香烴的過氧化形成高毒性的酮等。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的關鍵酶和限速酶，PPO能催化酚氧化生成醌以及聚合形成的單寧類物質。杧果感染病原菌后三者活性變化如圖4所示。POD活性在接種0～45 d內快速上升，酶活力頂峰出現的時間是接種后第60天，后期酶活力略下降，但仍維持在較高的活性水平。PAL活性與類黃酮含量的變化趨勢基本一致，呈先上升后下降的趨勢，接種病原菌30 d時處于頂峰；PPO在接種病原菌45 d內變化不明顯，隨后不斷上升，接種病原菌105 d后仍處于較高水平，約是對照處理的2.14倍。

2.5 病健杧果頂芽主要酚類含量差異分析

以沒食子酸、肉桂酸等9種酚為檢測對象，比較接種病原菌后杧果頂芽內酚含量的差異情況，結果如表2所示。供試的9種酚中楊梅酸和白藜蘆醇在試驗階段無明顯變化；沒食子酸、蘆丁、槲皮素、肉桂酸和反肉桂酸在接種病原菌45 d時均有不同程度的升高，但接種病原菌105 d時均顯著低于對照處理。其中綠原酸、肉桂酸和反肉桂酸變化量最大，接種病原菌45 d時分別是對照處理的2.84、2.12和2.44倍。

3 討論與結論

植物體內的酚類物質通過抑菌和殺菌作用、鈍化毒素、去除自由基和抗脂質過氧化作用等方式參與植物的抗病反應[1]。反之，病原菌侵染植物時，必然也在一定程度上影響到植物體內原有的酚類代謝平衡[8]。在有關病原物與植物互作的研究中，植物能否抵抗住病原菌的侵染在一定程度上取決于酚類物質的合成速度和保持高濃度的時間[4，14]。研究結果表明，抗病品種受植物侵染后組織內酚類物質迅速積累且較長時間內維持在高峰狀態，而感病品種在感病初期酚類物質積累慢進而不能有效地阻止病原菌的侵入。Prats等[15]研究發現向日葵體內酚類物質的含量與其抗性水平、接種時間和取樣部位存在一定的相關性，抗病品種內酚類物質總量顯著高于感病品種和未接種處理，且提取的酚類物質對核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）的生長具有明顯的抑制作用。因此可以認為只有當酚類物質的濃度達到足夠的量并長久維持，才能對病原菌有明顯的抑制和阻礙作用[16-17]。PAL是苯丙烷代謝途徑中酚類、植保素和木質素等抗菌物質合成的關鍵酶，一般認為PAL活性的增強對植物抗病是有利的。PPO能夠使酚類物質轉變為具有高毒性的醌類物質，對病原物果膠分解酶等活性具有強烈的抑制作用[18]。郭紅蓮等[19]研究了玉米灰斑病菌（Cercosporazeae maydis）侵染4個玉米品種前后PAL、POD、PPO及木質素含量的變化，3種酶的活性在抗感病品種中碼，隨著病原菌的侵染都發生了明顯的變化。Mikulic-Petkovsek等[20]利用HPLC-MS分析了辣椒受炭疽菌感染后其體內酚類物質的種類與及其含量變化的情況，并評估了酚類物質在寄主防御機制中的作用，研究發現，在健康組織、感病組織和病健交界區共檢測到21種酚類物質，其中芹菜素、槲皮素、藤黃菌素、綠原酸和金圣草素等含量較多。在病健交界區，槲皮素、藤黃菌素、綠原酸和金圣草素的含量顯著高于健康組織，而芹菜素含量與健康組織無明顯差異，由此推斷，芹菜素在辣椒的防御體制中作用不明顯，病健交界區強烈的酚類物質合成能力促進了其體內酚類物質總量不斷上升，進而阻礙了病原菌的進一步蔓延[20]。本試驗研究結果表明，酚類物質與杧果抗畸形病有著較密切的關系，接種病原菌45 d后，總酚含量和PAL活性迅速提高是相同時期對照處理的2倍左右，表明酚類代謝參與杧果的抗病反應，是杧果對病原菌侵染的應激反應之一。接種病原菌后期，F. mangiferae成功侵染杧果，頂芽內的正常代謝途徑發生紊亂，杧果體內總酚含量及PAL活性急速下降，失去了對病原菌的阻礙和抑制作用，因而引發了病害的產生。本研究只是初步探討了POD、PAL、PPO及酚類物質與抗病性的相關性，對其他抗病因子如植保素和一些抗原蛋白及誘發抗菌物質的其他酶類如ATPase等也應進行廣泛和深入的探討。由研究結果可以推測，PAL和酚類含量可能是杧果抗畸形病的鑒定指標，因而充分利用這些生化因子來進行下一步的研究工作，探索不同品種的杧果對F. mangiferae抗性機制的差異，可以為以后的抗病育種工作打下理論基礎。

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