貝母甲素含量測定方法研究進展

摘要：綜述了貝母甲素含量測定方法的研究進展，包括紫外一可見分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法、超高效液相色譜法、高效液相色譜一差熱聯用技術等，為貝母甲素的含量測定提供參考。

關鍵詞：貝母甲素；含量測定；研究進展

O引言

貝母甲素來源于百合科植物川貝母和浙貝母的干燥鱗莖。貝母甲素是一種生物堿，白色針狀晶體，可溶于有機溶劑，不溶于水、石油乙醚。貝母甲素有清熱潤肺、止咳化痰功效，用于治療痰熱咳嗽，心肺郁積，咳嗽及氣管炎。目前貝母甲素含量測定方法很多，如分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法等。本文對其含量測定方法研究進展進行綜述。

1 紫外一一可見分光光度法

紫外——可見分光光度法是根據物質分子對波長為200～760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結構分析方法。操作簡單、準確度高、重現性好。鄺翠儀等人發現貝母甲素在2368～11.84μg/ml范圍內線性關系良好，貝母甲素平均回收率測定為97.7%，RSD=4.2%。尹尚軍等采用超聲波輔助提取法分離浙貝母生物堿，并用分光光度法測定其含量。結果表明，吸光度值與貝母素甲質量濃度呈良好的線性關系，不同產地對浙貝母生物堿含量的影響較大，而且不同組織部位的含量不盡相同。

2 薄層掃描法（TLC）

薄層掃描法檢測的靈敏度、結果的精密度與準確度均良好。與高效液相色譜法相比，具有多通道效應，可同時平行分離分析多個樣品；流動相用量少且選擇范圍寬、更換方便；固定相為一次性使用，對樣品的預處理要求不高等優點。在中藥制劑檢驗中，已成為重要的常用分析方法之一。《中國藥典》中有33個中成藥品種采用該法進行含量測定。

薄層掃描法的薄層板多采用硅膠G，展開劑多采用氯仿一甲醇一水（65：35：10），顯色劑一般為10%硫酸乙醇。宋紅湘等用薄層掃描儀對婦康消腫丸中貝母素甲進行了含量測定。其中做層析分析時，貝母素甲在502 nm處有最大吸收；掃描結果表明在0.41-2.05μg之間；積分值與點樣量間線性關系良好。經加樣回收試驗和精密度試驗表明測定結果可行。同時侯文峰等建議復方制劑成分復雜，可按干燥計算；薄層板展開時盡量在低溫下展開，溫度控制在60%-70%左右，分離效果較好。

3 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，具有高壓高效高靈敏度，應用范圍廣等優點，在中藥含量測定中應用廣泛。

3.1 UV檢測器

紫外線檢測器（UV）原理是Lamber-Beer定律，即當一束單色光透過流動池時，若流動相不吸收光，則吸收度A與吸光組分濃度C和流動池光徑長度成正比。UV檢測器優點是選擇性高、靈敏性好。廣泛適用于有機分子具紫外或可見光吸收基團，有較強的紫外或可見光吸收能力的物質檢測。

一般當物質在200-400nm有紫外吸收。吳曉民測不同產地平貝母中貝母甲素含量采用Kro-masil ODS C18（4.6mmx250mm，5μm）色譜柱，流動相為甲醇一水（69：31），體積流量為0.5mL.min-l；柱溫為27°C；檢測波長為208nm，貝母甲素在0.515 -3.09μg與峰面積線性關系良好（r=0.9997），平均加樣回收率為98.54%，RSD為2.12%（n=5）。本方法靈敏度高，而且簡便、準確、重現性好內，可用于平貝母的內在質量控制。

3.2 ELSD檢測器

蒸發散射檢測器（EISD）原理適用于所有待測物的揮發性低于流動相的分離。現在ELSD越來越多的作為通用性檢測器。它最大的優點在于檢測不含發色團化合物。如碳水化合物、脂類等。并在沒有標準品和化合物結構參數未知的情況下檢測未知化合物。ELSD廣泛應用于皂苷類成分、萜類成分及生物堿成分分析。

貝母甲素通常采用Lichrospher C18，柱溫一般不超過40℃，流動相為乙腈一水或甲醇一水，流速一般不超過ImL/min。趙琰玲等人采用高效液相色譜ELSD法測定參貝止咳片中的貝母素甲含量。選用色譜柱（250mmx4.6mm，Spm），柱溫30度，流動相為乙腈-0.05%-乙胺溶液（70：30），流速為l.Oml/min，載氣（氮氣）流速2.5L/min，漂移管溫度70度。貝母素甲進樣量對數與峰面積對數具有良好的線性關系。該方法可靠準確、重復性好可用于制劑含量測定及質量控制。姜艷等人采用高效液相色譜ELSD法測定浙貝母中貝母素甲含量。采用色譜柱Agilent Hypersil BDS-C18（4.Omm×250mm，5μm），流動相為乙腈一水一二乙胺（70：30：0.03），流速0.8ml/min，漂移管溫度85度，載氣流速2.2L/min。貝母素甲線性范圍47.02～1003mg/L，平均回收率分別102.7%，RSD分別為2.1%（n=6）。此法簡便快捷，結果可靠，可用于浙貝母質量評價。

3.3 MS檢測器

質譜法（MS）利用電磁學原理，對荷電分子或亞分子裂片依其質量和電荷的比值進行分離和分析的方法。質譜法優點分析速度快、靈敏度高、高分辨率。質譜法廣泛應用于各個學科領域中通過制備、分離、檢測氣相離子來鑒定化合物的一種專門技術。質譜法具有高特異性和高敏感度且得到廣泛應用的普適用法。

質譜法多采用C18色譜柱。柱溫為室溫，流動相為乙腈一水，流速不超過IMUmin。張杰雯等人[7]應用高效液相色譜一質譜聯用對貝母生物堿中貝母甲素進行檢測。貝母用氨水浸潤后，以乙醚一氯仿一乙醇f25：8：2.5）超聲提取。將提取物直接進樣到電噴霧離子阱質譜檢測器進行檢測。質譜采用電噴霧正離子模式（ESI+），掃描范圍為m/z 210～800，貝母甲素的選擇性檢測離子分別為m/z 432。采用色譜柱為SphrigelC18（200mm×4.6mm，Sμm），流動相為乙腈-lOmmol.L-1甲酸銨（pH=8.0，0.03%三乙胺），梯度洗脫（0～6min：乙腈300-/0一45%；6- 22min：乙腈45%；22 - 30min：乙腈450%→95%；30～34mni：乙腈30%），流速ImL.min-1，柱溫25℃。川貝母與浙貝母總生物堿提取液的一級質譜圖顯示，其主要分子離子峰基本相同，相對豐度有較大差異。相關系數均大于0.999，方法回收率均大于97%，日內、日間精密度（RsD）分別小于1.3%和2.8%（n=5）。本方法靈敏度高，專屬性強，簡便快捷，線性關系良好，適用于貝母中無紫外吸收的異街體生物堿的檢測與分析。俞瀅等人利用HPLC-MS測定癃閉康泰片中貝母甲素含量。癃閉康泰片經堿化，用氯仿一甲醇（4：1）提取生物堿有效部位，提取液濃縮，殘渣用甲醇溶解后，進行高效液相色譜一質譜測定。色譜柱為AgilentZorbax extend C18（2.1 mmxl00 mm，Sμm），流動相為乙腈和10 mmol.L-1甲酸銨（pH 8.0），梯度洗脫（0～15 min：乙腈30%～55%；15～25min：乙腈55%），流速0.2mL.min-l，柱溫30℃。質譜條件為電噴霧電離源（ESI），以選擇性正離子方式檢測，貝母素甲的選擇性檢測離子分別為m/z 432.4。貝母素甲的線性范圍均為0.01～10 mg.1-l，相關系數均大于0.999，檢測限均為0.45μg- 1-1，方法回收率均大于95%，日內日間精密度（RSD）均小于5%。本方法專屬性強，靈敏度高，線性關系良好，操作簡便，適用于癃閉康泰中貝母素甲含量測定。

4 其他方法

4.1 高效液相色譜一差熱聯用技術（HPLC-DTA）

高效液相色譜一差熱聯用技術，方法簡便，快速，結果準確，可用于中藥的質量標準研究及質量檢驗。程存歸等用高效液相色譜法和差熱分析法，來進行不同品種及不同加工法的浙貝母質量分析。差熱分析時，不同的升溫速率對差熱圖譜峰形有影響。

4.2超高效液相色譜法（UPLC）

超高效液相色譜借助HPLC的理論及原理，是分離科學的一個全新類別。超高效液相色譜作為一個新興領域，目前已經開始投入液相實驗中。董林毅采用Water Acquit BEH C18色譜柱（2.lmmlOOxmm，1.7μm），流動相為乙腈一甲酸一水體系梯度洗脫，流速為0.4ml/min，PDA檢測190-400nm掃描；進樣量為2.Oμl。6種成分在一定范圍內均呈現良好線性。γ均大于0.996，精密度、重復性和穩定性良好。該方法簡單、準確、快速、重復性好。

5 結論

貝母甲素含量的測定研究很多，液相色譜法重復性好，可用于含貝母甲素的制劑的含量測定及質量控制；隨后是高效液相色譜的普及使用，專屬性強，線性關系良好，操作簡便；其中蒸發光散射器靈敏度高，所受干擾因素少，現在多用此法來評價貝母甲素的質量。隨著色譜技術不斷創新，在高效液相色譜的基礎上涌現出超高效液相色譜和高分離度快速液相色譜，大大提高了分析速率，縮短了分析時間，開始逐漸應用于貝母甲素的含量測定。