分子生物學技術在污水處理微生物檢測中的應用

【摘 要】當前我國的水資源數量不斷減少，質量也在不斷的下降，為了緩解水資源的現狀，相關的研究人員也在對污水處理微生物檢測技術上下了很大的功夫，這些技術的發展和應用使得我國的污水處理和檢測工作有了一定的進展，其中，分子生物學技術就是其中之一，本文主要分析了分子生物學技術在污水處理微生物檢測中的應用，以供參考和借鑒。

【關鍵詞】污水生物處理；分子生物學技術；微生物群落分析

0.引言

傳統的生物法在污水處理和微生物檢測方面都存在著非常大的不足，傳統的方法只可以培養十分之一左右的微生物，但是活性污泥當中所生存的細菌群落不是所有的都適合使用培養的方法對其進行詳細的分析，同時其也不能很好的揭示生物反應器當中的變化和其所能傳遞出的信息，而使用分子生物學技術就可以很好的避免這些問題和不足，所以我們必須要對其予以高度的重視。

1.限制性片段長度多態性分析

在對限制性片段長度進行多態性分析的時候，DNA慧聰混合微生物群落當中被順利的提取出來，通過詳細的分析可以提供一些比較有價值的群落基因指紋信息，在這一過程中可以充分的利用限制性酶切之后DNA片段大小的不同特征將其分離，這種方法在應用過程中具有非常明顯的優點，它不需要放射性標記的探針雜交流程就可以非常清晰的觀察到整個過程中所產生的結果。

2.寡核苷酸探針技術

寡核苷酸或者是核算探針的方法借助分析和列舉群落當中微生物的遺傳信息來展現群落自身的結構，其主要的原理就是特定的微生物在DNA和RNA當中的裴烈順序是不同的，而在實際的檢驗檢測工作中針對群落的RNA進行寡核苷酸探針是非常直接的一種方式，一般情況下探針的堿基序列和目標細胞RNA上的某一個區域是存在著非常強的互補關系的，同時在這一過程中還要對檢測的環境和條件予以嚴格的控制，這樣就可以使得探針DNA個目標細胞中的RNA能夠得到緊密的固定，如果RNA被固定之后就可以將沒有雜交的探針沖洗的非常的干凈，在實際的工作中，工作人員只要對雜交探針的數目予以確認就可以確定RNA是否存在，如果存在，其數量大致是多少。

寡核苷酸雜交作用一般可以通過兩種方法進行對比，一種方法是狹線印跡法，這種方法相對比較傳統，它主要是要將RNA從樣品當中提取出來，當前我們經常用的方法是不需要提取RNA就可以實現同樣功能的熒光原位雜交。

熒光原位雜交是將分子生物學技術的精確性和顯微鏡的可視性有機的結合在一起，這樣就可以充分的在非常自然的微生物檢測當中對不同類型的微生物進行鑒定，同時還可以對污水處理過程中污水所含的微生物數量以及空間分布等重要的信息予以顯現，這項技術的主要工作原理就是要通過開通雜交探針的熒光信號來對核酸序列進行檢測。，所以這種方法和傳統的方法相比有著非常大的優勢，得到了較為廣泛的應用。

寡核苷酸技術在應用過程中所展現出的一個最大的特點就是它能夠將探針設計的特異性充分的顯示出來，這樣一來就可以獲得群落自身的結構信息，但是這種檢測方式的準確性實際上和探針的特異性有著非常密切的關聯，所以在這一過程中，我們一定要對探針的設計工作予以高度的重視。針對那些沒有經過培養的細菌，我們首先需要采用雜交的方式對其進行鑒定，這樣就可以知道探針是否足夠合理。此外在這種方法應用的過程中還存在的一個非常重要的問題就是會出現假陽性結果，因為微生物在生長的過程中會產生一定的熒光作用，這樣一來就會對檢測的結果形成非常大的干擾，同時環境樣品當中的殘留物也會使得整個分析過程變得更加的復雜，因此在檢測位置混合菌群的時候，一定要采取有效的措施來避免自身背景熒光的干擾，這樣也就減少了假陽性出現的幾率。

最近幾年，很多檢測技術都得到了相對比較廣泛的應用，同時在很多領域都收到了很好的應用效果，其中FISH技術和其他技術也在不斷的融合，這也對環境微生物學研究工作提供了非常好的條件，這種技術上的融合也使得圖像更加的清晰，檢測結果也更加的準確。

3.DNA生物傳感器

生物傳感器設計的理論基礎是固定化生物層與目標污染物之間的專一性作用.基于生物催化和免疫原理的生物傳感器在環境領域得到了廣泛的應用盡管以核酸探針為敏感元件的傳感器在環境檢測中的應用尚處于起步階段，但分子生物學與生物技術的發展為研究DNA生物傳感器提供了可能.核酸雜交生物傳感器的理論基礎是DNA堿基配對原理，其高度專一性的DNA雜交反應與高靈敏度的電化學檢測器相結合形成的DNA雜交生物傳感器除了可用于微生物的核酸序列分析、微量污染物的檢測外，還可用于研究污染物與DNA之間的相互作用，為解釋污染物毒性作用機理提供了可能。

研究人員開發了電化學DNA傳感器進行水體中aromaticamines的檢測；還有一些人開發出了DNA雜交生物傳感器并用于環境樣品的微生物檢測，如水體中病原菌Cryptosporidium的測定等.這類傳感器的研究包括核酸探針固定化的優化、雜交反應條件、指示劑的結合與檢測等.雜交過程并不是一個簡單的在液相中探針與DNA片段按堿基配對規則形成雙鏈的反應.影響雜交的因素很多，特別要注意影響雜交反應動力學和效率的因素，包括雜交時間、離子強度、探針長度、序列和雜交溫度等，以保證其高度專一性和靈敏度。

4.DNA重組技術

20世紀70年代初，限制性核酸內切酶的發現為DNA重組技術的建立揭開序幕.DNA重組技術的實質是，將兩個或多個單獨的DNA片段連接起來產生一個能在特定宿主中自主復制的DNA分子.其基本程序是：外源DNA的獲得；選擇載體并進行處理；將目的DNA片段和處理后的載體連接；將連接產物導入合適的宿主細胞內，使重組DNA分子在宿主細胞內復制擴增；將轉化菌落在平板培養基上培養成單個菌落，篩選獲得含有重組DNA的陽性克隆.在廢水的處理過程中僅靠分離和篩選的功能性微生物是不夠的.如上所述，在混合的微生物群體中篩選特定的微生物菌種時往往得不到預期的結果；特定的微生物可能難以培養，從而無法應用到實際的生物反應器中；人類排放到環境中的污染物越來越復雜且難以處理.因此，有必要通過基因工程技術并根據具體的需要構建有效的基因工程菌或培育出可高效降解復雜多樣的有害污染物的細菌來解決以上的問題。

指示菌在廢水的微生物動態檢測中具有重要意義.由于指示菌具有較高的存活力且對環境中特定物質的變化比較敏感，所以采用指示菌可以迅速、明確地反映污水中成分的改變情況.運用分子生物學技術中的基因重組技術可以把特定的基因整合到某些微生物的基因組中，再把這些基因工程菌釋放到特定環境中，從而達到對環境進行監測的目的.必須明確的是，作為指示菌的基因工程菌至少應具有如下特點：含有易于被擴增、檢測和定量的外源基因；在特定環境中具有較高的存活力；對環境中特定物質的變化比較敏感。研究人員把一種單胞菌進行基因工程處理，使其包含甘露醇冠癭堿分解代謝的基因，通過在冰草氨酸和甘露氨酸中生長，這些微生物可以從環境樣品中提取出來，對菌株構建時產生的融合區域進行PCR擴增，就可以進行靈敏的特異性檢測。

5.結語

在上個世紀的80年代，一DNA序列和相關結構基因為主要研究內容的分子生物學技術已經逐漸的走出了初步發展的階段，同時在整個世界范圍都得到了非常廣泛的普及，環境工程學、醫學、生物學方面也有了很大的進步，分子生物學在這一過程中也在和許多其他的技術不斷的融合，這也使得這項技術在污水處理微生物方面發揮了更大的作用。

【參考文獻】

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