RP—HPLC測定不同品種黃連中的黃連堿和表小檗堿

【摘 要】本文采用高校液相測定了不同品種黃連中黃連堿和表小檗堿的含量，固定相為：安捷倫Cl8（4.6mm×250mm，5um），以乙腈-0.05%磷酸二氫鈉-0.05%十二烷基硫酸鈉-磷酸（30：35：35：0.01）為流動相，檢測波長為345nm；表小檗堿在10～40μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系；黃連堿在100～400μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。表小檗堿和黃連堿的平均回收率分別為99.5%、99.6%，RSD為0.53%（n=6）、0.55%（n=6）；此方法簡便、準確、重現性好，可用于黃連中表小檗堿和黃連堿的含量測定。

【關鍵詞】黃連；表小檗堿；黃連堿

黃連，屬毛莨科黃連屬，是一種常用中藥，最早載于《神農本草經》。《神農本草經》記載：“味苦，寒。主治熱氣，目痛，眥傷，泣出，明目，腸澼，腹痛，下痢，婦人陰中腫痛。久服令人不忘。”黃連具有抗菌、抗真、抗病毒、抗阿米巴、抗炎、抗腹瀉、對心血管、解熱、降血糖、降血脂、抗氧化、抗潰瘍等作用。黃連主要分布于四川、貴州、湖南、湖北、陜西南部等地。黃連堿為黃連主要成分之一。黃連堿具有抗微生物活性；對胃粘膜有保護作用；抗癌作用；抗腎炎作用[1]。本文采用高校液相測定了不同品種黃連中黃連堿和表小檗堿的含量。

1.儀器與試藥

海能LC7000四元低壓梯度系統（濟南海能儀器股份有限公司）；TBL10-250C雙頻加熱型超聲波清洗器（天津市恒奧科技發展有限公司）；上海元析UV-9000型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HH-601超級恒溫水浴（江蘇金壇市億通電子有限公司）；賽多利斯BSA124S電子天平（廣州市深華生物技術有限公司）；SK250HP功率可調臺式超聲波清洗器（上海壘固儀器有限公司）；Histoon Lab I-05實驗室超純水器（科爾頓（中國）有限公司）。表小檗堿和黃連堿對照品由中國藥品生物制品檢定所提供。乙腈（東莞市譜標實驗器材科技有限公司）、甲醇（東莞市譜標實驗器材科技有限公司）、醋酸鈉（上海楚柏實驗室設備有限公司）、磷酸二氫鈉（上海亨代勞生物有限公司）、溴化四丁基銨（南寧市恒源化工有限公司）、三乙胺（上海楚柏實驗室設備有限公司）、四氫呋喃（上海亨代勞生物有限公司）、磷酸（上海亨代勞生物有限公司）。

2.含量測定

2.1色譜條件

依據查閱文獻及考查的結果[2-6] ，確定色譜條件如下。色譜柱為安捷倫Cl8規格為（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為乙腈-0.05%磷酸二氫鈉-0.05%十二烷基硫酸鈉-磷酸（30：35：35：0.01）；檢測波長為345nm；流速1.0mL·min-1；柱溫：30℃。理論板數按黃連堿峰計算應不得低于2000。

2.2供試品溶液的制備

取黃連適量，精密量取，置50mL量瓶中，加3%鹽酸甲醇溶液適量，超聲處理五十分鐘，放置至室溫，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。

2.3對照品溶液的制備

分別精密稱取黃連堿和表小檗堿對照品20mg、2mg，置100mL容量瓶中，用70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4標準曲線的制備

制備濃度為10μg·mL-1、15μg·mL-1、20μg·mL-1、25μg·mL-1、30μg·mL-1、35μg·mL-1、40μg·mL-1的表小檗堿對照品溶液，制備濃度為100μg·mL-1、150μg·mL-1、200μg·mL-1、250μg·mL-1、300μg·mL-1、350μg·mL-1、400μg·mL-1的黃連堿對照品溶液。分別按表小檗堿、黃連堿的測定參數繼續測定。以吸光度為橫坐標，濃度為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。試驗表明，表小檗堿在10～40μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系；黃連堿在100～400μg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

2.5精密度試驗

依照2.3項下制備對照品溶液，分別精密吸取表小檗堿和黃連堿對照品溶液重復測定6次，測定峰面積積分值，對照品峰面積積分值的RSD分別為0.69%和0.79%。結果表明，本實驗精密度良好。

2.6重現性試驗

分別稱取同批黃連樣品6份，分別依照2.3項下供試品制備方法制備供試品，按質量標準含量測定項下方法測定含量，并計算樣品的RSD值，RSD值為0.65%，0.63%，結果表明，此含量測定方法的重現性良好。

2.7穩定性試驗

依照2.3項下供試品制備方法制備供試品溶液，分別在0，2，4，8h進樣測定，供試品表小檗堿和黃連堿峰面積的RSD分別為0.77%和0.81%。結果表明表小檗堿和黃連堿至少在8h內穩定。

2.8回收率試驗

采用加樣回收試驗，取已知含量的同一批供試品各6份，分精密添加一定量的表小檗堿和黃連堿對照品，按供試品制備所述方法制備供試品溶液，測定含量，計算回收率。6次測定的平均回收率分別為99.5%和99.6%，RSD分別為0.53%和0.55%。

2.9樣品含量測定

依照上述含量測定方法，測定不同產地黃連中表小檗堿和黃連堿的含量，結果貴州表小檗堿和黃連堿含量分別為百分之一點三，百分之一點九；四川石柱表小檗堿和黃連堿含量分別為百分之一點無，百分之一點八；四川巫溪表小檗堿和黃連堿含量分別為百分之一點一，百分之二點三；湖北房縣表小檗堿和黃連堿含量分別為百分之零點九，百分之二點二；四川峨嵋表小檗堿和黃連堿含量分別為百分之一點六，百分之一點一；云南德欽表小檗堿和黃連堿含量分別為百分之一點九，百分之零點九；云南碧江表小檗堿和黃連堿含量分別為百分之二點一，百分之一點一。

3.討論

分別考察甲醇-四氫呋喃-0.075mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5）（30：20：50），乙腈-0.05%磷酸二氫鈉-0.05%十二烷基硫酸鈉-磷酸（40：30：30：0.01），甲醇-四氫呋喃-0.075mol/L醋酸鈉緩沖液（pH5.0）（30：20：50），甲醇-乙腈-水（20：20：60），乙腈-1.0%醋酸溶液（32∶68），乙腈-0.05%磷酸二氫鈉-0.05%十二烷基硫酸鈉-磷酸（30：35：35：0.01）為流動相，結果以乙腈-0.05%磷酸二氫鈉-0.05%十二烷基硫酸鈉-磷酸（30：35：35：0.01）為流動相，供試品各峰分離效果最好，故選用乙腈-0.05%磷酸二氫鈉-0.05%十二烷基硫酸鈉-磷酸（30：35：35：0.01）為流動相。 [科]

【參考文獻】

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[3]李建光，韓松林，趙東升，張海波，耿晶，李新霞.一測多評法測定新疆兩種洋甘菊中5種化學成分含量[J].醫藥導報，2014（11）.

[4]田原，于艷，陳雪，閆冬，徐晶.大孔吸附樹脂純化黃連中4種生物堿的含量測定[J].中華中醫藥學刊，2014（05）.

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