腸道病毒71型（EV71）的檢測

[摘要] 目的 探討腸道病毒71型（EV71）的檢測方法。 方法 采用酶聯免疫法（ELISA法）、 免疫膠體金法（膠體金法）、 熒光定量PCR法（PCR法）對1399例手足口病患兒的樣本進行檢測，并對檢測結果進行卡方檢驗。 結果 1399例手足口病患兒樣本ELISA法、金標法、PCR法結果的陽性率分別為37.8%、36.0%、39.8%，三種方法檢驗結果無顯著性差異（χ2=4.197，P>0.05）。ELISA法與膠體金法及PCR法結果比較均無顯著性差異（χ2=0.959，P>0.05；χ2=1.180，P>0.05）；膠體金法與PCR法兩者之間差異有統計學意義（χ2=4.26，P<0.05）。 結論 這三種腸道病毒71型（EV71）檢測方法無顯著差異，但膠體金法方便快捷，PCR法精準，ELISA法可作為常規使用。

[關鍵詞] 腸道病毒；EV71；膠體金法； ELISA；PCR

[中圖分類號] R446.6；R450 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2015）20-0093-03

Detection of enterovirus 71 （EV71）

ZHANG Xianhua

Laboratory Department， the Fifth People's Hospital of Anyang City in He'nan Province， Anyang 455000， China

[Abstract] Objective To investigate the enterovirus 71 （EV71） detection methods. Methods Samples from 1399 children with hand， foot and mouth disease were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， immune colloidal gold method （colloidal gold method） and fluorescence quantitative PCR method （PCR method）， and the chi-square test was conducted on these detention results. Results The positive rates of samples from 1399 children with hand， foot and mouth disease by the ELISA method， the gold standard method and the PCR method were 37.8%， 36.0% and 39.8%， respectively， without significant difference（χ2=4.197， P>0.05）. The colloidal gold method and the PCR method had no significant differences （χ2=0.959， P>0.05； χ2=1.180， P> 0.05）. The colloidal gold method and the PCR method， had significant difference between the two methods （χ2=4.26， P<0.05）. Conclusion There is no significant difference among the three enterovirus 71 （EV71） detection methods. But the colloidal gold method is more convenient， and the PCR method is more precise. ELISA method can be used for routine detection.

[Key words] Enterovirus； EV71； Colloidal gold method； ELISA； PCR

腸道病毒71型（EV71）是一類常見的經呼吸道和消化道感染人體的病毒。可經腸道（糞-口途徑）傳播，也可經呼吸（飛沫、咳嗽、打噴嚏等）傳播，亦可因接觸患者口鼻分泌物、皮膚或黏膜皰疹液及被污染的手及物品等造成傳播。以5歲及以下兒童為主，尤以3歲以下的兒童發病率最高。EV71感染可導致手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎、腦炎、肺炎、心肌炎等癥狀或并發癥，嚴重者可導致死亡[1-3]。所以探尋一個快速、準確的檢測方法十分必要。我科為此對1399例手足口病患者的樣本分別采用ELISA法、膠體金法、PCR法進行檢測，并將檢測結果進行統計學分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1399例手足口患兒均來自我院2014年4月1日～9月30日住院患者，診斷符合2012年國際手足口病會議關于手足口病診斷標準[4]，其中男887例，女512例；平均年齡2.8歲。標本ELISA法、膠體金法用普通真空負壓管采集靜脈血后，分離血清；PCR法用無菌咽拭子采集患兒咽峽部黏膜皰疹液。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器 SLAN-96P全自動醫用PCR分析系統，上海宏石醫療科技有限公司；RT-2100C酶標分析儀、RT-2600C全自動洗板機，深圳雷杜生命科學股份有限公司。操作由專業技術人員嚴格按操作規程操作。

1.2.2 試劑 膠體金法 腸道病毒71型IGM抗體檢測試劑盒，北京新興四環生物技術有限公司；ELISA法 腸道病毒71型抗體（IGM）檢測試劑盒，北京貝爾生物工程有限公司；PCR法 腸道病毒71型核酸檢測試劑盒，湖南圣湘生物科技有限公司。

1.3方法

①膠體金法：采用膠體金免疫層析技術原理[5]，在金標墊上包被膠體金標記的鼠抗人IgM。用于定性檢測全血、血清或血漿樣品中的腸道病毒71型IgM抗體（EV71-IgM）。檢測陽性樣品時，樣品中的腸道病毒71型IgM抗體可與膠體金標記的鼠抗人IgM結合，形成免疫復合物，由于層析作用復合物及樣品在硝酸纖維素膜內部向前流動，當復合物經過T線時與包被的重組EV71-Ag結合，形成“Au-鼠抗人IgM- EV71-IgM-EV71-Ag”而凝集顯色、剩余的膠體金標記的鼠抗人IgM與C線處包被的羊抗鼠IgG抗體結合而凝集顯色，檢測陰性樣品時，樣品中不含腸道病毒71型IgM抗體，致使不能形成免疫復合物，則只能在C線處顯色。②ELISA法：采用捕獲法原理檢測人血清或血漿樣品中腸道病毒71型IgM抗體（EV71-IgM），微孔中預包被鼠抗人IgM（μ鏈）。首先加入待檢標本的血清或血漿樣品后，樣品中的IgM抗體都可被捕獲，未結合的其他成份（包括特異性的IgG抗體）將被洗滌除去；第二步：加入腸道病毒71型抗原標記酶，被捕獲的IgM中的EV71-IgM會與辣根過氧化物酶標記的EV71重組抗原特異性結合，洗去其他未結合物，最后加底物TMB顯色，通過酶標儀檢測吸光度（A值）從而判定樣品中的EV71-IgM抗體的存在與否；③PCR法：在體外模擬病毒核酸的復制過程，針對EV71核酸保守區設計特異性引物和特異性熒光探針，配以RT-PCR反應液，在熒光定量PCR儀上，應用實時熒光定量PCR檢測技術，通過熒光信號的變化實現EV71-RNA的快速檢測；其檢測體系中含有陽性內對照（內標），通過檢測內標是否正常來監測待測樣本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假陰性；通過與標準曲線比對得出定量結果。

1.4統計學方法

采用SPSS19.0統計學軟件，計數資料比較應用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

1399例手足口病患兒的樣本分別采用ELISA法、膠體金法、PCR法進行檢測，其腸道病毒71型檢測結果見表1。ELISA法與膠體金法、PCR法比較均無顯著性差異（χ2=0.959，P>0.05；χ2=1.180，P>0.05）；膠體金法與PCR法比較，兩者之間差異有統計學意義（χ2=4.26，P<0.05）。

3討論

目前隨著檢驗醫學的快速發展，相關的檢驗技術也得到了不斷提高，檢驗方法也層出不窮，檢測的準確性、靈敏度也大大增加；病毒的檢測方法也從血清學發展到分子生物學檢測。腸道病毒71型（enterovirus71，EV 71）作為引起手足口病（hand foot mouth disease， HFMD）的最常見病毒，不僅可引起患兒發熱和手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，還可引起個別患者心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發癥；更是重癥患兒的原兇[4，6-10]。近年手足口病流行，國家疾控部門非常重視，其檢測技術也更加完善齊全。

膠體金免疫技術（colloial gold immunoassay）是以膠體金作為示蹤標記物或顯色劑，應用于抗原抗體反應的一種標記免疫測定技術[11]。金標法是國際上較為先進的、靈敏、特異、快速、簡便、準確率高的體外診斷方法。測定結果僅憑特制的檢驗盒在短時間內即可獲得。

ELISA技術將抗原抗體反應的特異性與酶高效催化底物的敏感性結合，反應在固相上進行，便于洗凈對試驗有干擾的非特異無關物質，操作快速簡便，可定性也可定量報告結果，適于大批量標本檢測；其憑借高度的敏感性和特異性、操作簡便以及試劑穩定、對環境沒有污染等特點，目前仍是臨床常規、科研工作的重要技術手段之一[11-12]。手足口病抗體檢測的最常用方法仍是血清學試驗、血清中和實驗及酶聯免疫法；該方法精確且具有型特異性。LMB組合血清可大大簡化鑒定過程，但是有些毒株的中和作用不穩定，仍需由單價血清來鑒定，另一要注意的是病毒顆粒的集聚會影響中和效果，如EV71的中和實驗就需要使用單個分散的病毒。而ELISA法相比而言操作簡便，可大批量自動化進行，成本低廉，患者易于接受。

PCR技術是從分子生物學水平直接檢測被檢病毒自身的遺傳物質，是病毒存在和復制的最可靠、最直接的標準[11]。已成為診斷病毒感染常用的一種方法，是診斷的金標準，但操作專業性強，成本貴，檢測費用高，患者難以承受。

由于方法學的局限性，膠體金法的檢測結果由人肉眼觀察判讀，易受目測誤差或主觀判讀等因素影響，因此，當條帶顏色不易明確判斷時，建議重復檢測；膠體金法的檢測結果作為診斷的輔助手段之一，檢測結果僅供參考，不作為臨床診治的唯一依據，陽性結果需采用其他方法進一步確認。感染初期，IgM未產生或滴度很低會導致金標法和ELISA法結果陰性，應提示患者1～2周內復查，復查時同時平行檢測上次采集的標本以確認是否出現血清學陽轉或滴度明顯升高。對于免疫功能受損或接受免疫抑制治療的患者，其血清學抗體檢測的參考價值有限。應采用單克隆抗體間接免疫熒光法檢測病毒抗原、RT-PCR技術檢測病毒核酸進行快速診斷[13-14]。

對于金標法和ELISA法其檢測樣本有一定要求：①靜脈采集的樣本，無論抗凝或非抗凝標本首先要及時充分離心分離血清或血漿，然后取澄清的液體進行檢測，如果末充分沉淀，懸浮的纖維蛋白可引起ELISA法假陽性和影響金標法的檢測。②標本中含有EDTA、枸櫞酸鈉、肝素鈉等抗凝劑時，通常不影響實驗結果；輕度膽紅素、血紅蛋白、血脂樣本通常不會影響實驗結果，但含量過高時則影響檢驗結果。③乙肝、丙肝、類風濕因子、EB病毒、CMV病毒、風疹病毒等相關疾病通常不會影響實驗結果。④血清或血漿樣本收集后5 d內檢測可4℃冷藏保存，大于5 d檢測樣本應放置-20℃冷凍保存，且避免反復凍融，最多不超過3次。金標法和ELISA法試劑要根據用量，用多少取多少，用前先讓試劑恢復室溫；用后及時收起，放置冰箱冷藏。PCR法則要求專業技術人員實驗前熟悉和掌握所需試劑和儀器的操作方法和注意事項，對每次試驗進行質量控制；嚴格按照PCR基因擴增實驗室的管理規范和操作規程進行操作，避免交叉污染，確保結果準確無誤。

由上述結果可以看出，采用ELISA法、膠體金法、PCR法進行腸道病毒71型檢測，其結果差異性不大；各醫療機構可根據不同診療目的和人群進行適當選擇，檢測結果應結合臨床檢查、病史及其他檢測綜合分析診斷。

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（收稿日期：2015-04-23）