小型動物實驗性肝纖維及肝硬化動物模型的研究進展

肝纖維化是由于慢性肝病所致的持續或反復的肝實質炎癥壞死而引起纖維結締組織大量增生， 其降解失衡導致肝內過多膠原沉積形成肝纖維化，肝纖維化為肝硬化早期階段。因此，慢性肝損傷動物模型的制備具有重要的研究意義。肝纖維化的防治是國內外研究的熱點，國內外對該模型的研究較多，為此筆者對幾種常用的肝纖維化模型復制方法、機制及該模型的優缺點加以綜述。

1 化學性肝損傷動物模型

1.1 四氯化碳中毒模型 該模型是國內外最廣泛應用的肝纖維化和肝損傷模型。將其溶于橄欖油、花生油等油溶液中，用濃度40% CCl4 ，按2ml/kg體重給予大鼠腹腔注射，2次/w，共8w～4個月不等。單純CCl4，一般采用30%～60%CCl4油劑皮下注射，劑量因動物種類而不同。小鼠采用1～3ml/kg體重，2次/w，肝硬化可在12～15w形成。該實驗病理學改變8w出現早期纖維化癥狀， 12w時肝小葉結構破壞， 間質纖維組織增生， 有明顯肝纖維化癥狀明顯增多， 出現由再生肝細胞形成的假小葉。但皮下注射過快，吸收入全身循環系統，腦腎毒性大，注射位置易發生浸潤性膿腫和潰瘍，故死亡率可高達30%～40%，降低CCl4濃度可降低死亡率，趙秋等[1]采用20%的CCl4死亡率為11%。亦用腹腔注射、灌胃、蒸汽吸入或拌于食物中快速口服的方法。呂明德等[2]采用飲食控制下，腹腔注射CCl4的方法制備犬肝硬變模型，也取得了滿意的結果。灌胃法優點在CCl4直接經門靜脈到達肝臟，1.5h后肝內即可達最高水平，采用此法者較多，皮下注射CCl4形成時間比較慢，不如灌胃法好，灌胃的缺點仍然是死亡率較高，有的高達到52.9%。許建明等[3]也采用CCl4和花生油混合液皮下注射，誘發小鼠肝纖維化模型，對不同期肝組織病理變化分析和肝臟生化指標的分析，結果發現，隨造模時間延長，肝纖維化程度有逐漸增加的趨勢。至造模后期，模型組動物的血清白蛋白比例明顯下降，可能系肝纖維化進行發展的后果，亦說明該模型后期可導致肝功能失代償。

1.2 二甲基亞硝胺致大鼠肝纖維化模型 二甲基亞硝胺（DMNA）是利用它所具有的肝毒性、基因毒性和免疫毒性，在動物體內的主要代謝為一種高反應活性化合物乙醛，可與體內生物大分子反應，破壞這些大分子的完整結構。低劑量長期應用可誘發肝腫瘤，大劑量可引起肝壞死和纖維化，常用二甲基亞硝胺，進入肝細胞經微粒體代謝生成乙醛損害肝細胞，同時產生活化的甲基，核酸與蛋白質甲基化致肝細胞壞死。大鼠按10mg/kg體重給予10g/L二甲基亞硝胺生理鹽水稀釋液， 腹腔注射共10次。用藥8w大鼠可引起肝纖維化。該模型可用于研究肝硬化向肝癌轉化機理。但由于是致癌物，實驗中慎用，同時這一模型死亡率較高。

1.3 硫代乙酰胺（thioacetamide， TAA） TAA具有直接肝毒性作用， 長期給藥可引起肝細胞的變性壞死甚至癌變。TAA常用于制作急性肝損傷、肝纖維化和肝性腦病模型。王春妍等采用皮下注射TAA600mg/kg制作大鼠急性肝損傷動物模型[4]。TAA可作用在肝細胞DNA、RNA和蛋白合成酶上產生毒性作用， 還可誘肝的代謝紊亂， 而致肝壞死王鶴樺等[5]用5%硫代乙酰胺（生理鹽水配制， 過濾除菌）皮下注射， 2次/w， 共12w， 誘導肝纖維化。此模型具有良好的可行性和重復性、肝纖維化組織接近人類，制備成功率高等優點， 常用于制作肝纖維化和急性肝功能衰竭模型。

1.4 D-氨基半乳糖（D-galactosamine， D-Galn） 半乳糖胺致肝損傷的機制主要是干擾核酸及蛋白質的合成， 造成內毒素血癥， 產生氧自由基及脂質過氧化導致膜機能障礙， 損傷線粒體致氧化磷酸化受損， 最終導致細胞死亡[6]。此外，D-GalN 也可通過破壞細胞內鈣穩態而起作用。給藥方式有皮下、腹腔內和靜脈注射。病理學特點是似小結節性，結節為再生肝細胞團，由結締組織包圍，為多層網狀纖維，可見膠原及彈性纖維。此種模型的癥狀、生化、組織學表現接近于人，重復性好，對肝纖維化、肝癌、肝衰竭、肝性腦病等研究有重要價值。但此法因 D-GalN 價格較高而使其應用受到限制。

2 免疫性肝損傷動物模型

2.1 腹腔注射異種血清 早在60年代就證明了免疫反應能引起肝損傷，異種動物血清或異體蛋白反復注入動物體內后，刺激動物形成過量的免疫復合物，抗原可用豬、牛、馬血清、豬白蛋白、血清球蛋白，人γ球蛋白等反復注射，5w引起肝纖維化，10w引起肝硬化。國內王寶恩等[7]于1989年創立了良好的免疫性肝硬化模型，采用不同方法通過人血清白蛋白來制備鼠肝纖維化模型。該模型在發病機理上歸屬免疫損傷，與人類慢性肝炎所致的肝纖維化較相似，因此適合免疫方面肝纖維化發病機制的研究，但仍與人類病毒性肝炎免疫損傷所致的肝硬化有差距，因其沒有病毒持續復制及肝實質持續損傷過程。

2.2 通過腹部皮膚感染血吸蟲法 動物如兔、小鼠感染血吸蟲后所致肝纖維化與人類肝纖維化較為接近。通過腹部皮膚使動物感染血吸蟲尾蚴，特別是小鼠被認為是研究纖維化因子剌激下膠原代謝等問題的最好模型。小鼠皮下注射曼氏血吸蟲尾蚴后6～8w，肝臟形成肉芽腫， 肝超聲顯像檢查，門脈區寄生蟲卵的免疫反應引起的炎癥，確定達到肝纖維化。此模型病變特殊，可用于研究血吸蟲病性肝硬化，但不適于研究其它類型的人類肝纖維化。

2.3 卡介苗（bacillus calmet te-guerin vaccine， BCG）和加脂多糖（lipopoly- saccha ride， LPS） BCG的損傷機制可能是小鼠注射BCG后導致多核中性粒細胞或巨噬細胞（肝內庫普弗細胞）聚集于肝臟并被致敏， 繼而用低劑量LPS攻擊， 促進其釋放大量對肝細胞有毒性作用的細胞因子，如白三烯、TNF、IL-1和NO等， NO作為自由基， 可以與O2- 反應生成超氧化亞硝酸陰離子（ONOO-） 以及其他自由基引起脂質過氧化造成肝細胞損害[8]。

2.4 尾靜脈注射血清蛋白 該方法通過大鼠尾靜脈注射人血清蛋白造成肝纖維化模型。2次/w，劑量從2.5mg開始，以后以0.5mg/w增加，直至增加到4mg，復制模型時間為2個月。該模型復制成功率高、重復性好、自然恢復慢、不易自發逆轉，且病理過程和形態學變化與人類肝纖維化及肝硬化相似，可用于篩選抗肝纖維化的藥物。但該模型尾靜脈注射操作要求高，反復注射可造成靜脈炎癥。以BCG漿液每只0.2ml（含>5×106菌）注射小鼠尾靜脈，致敏后10d，再尾靜脈注射LPS每只7.5μg，成功誘導小鼠肝損傷模型。確定BCG菌數 5.0×107+ LPS 劑量30μg/kg聯合最佳，能夠充分造成大鼠急性肝損傷[9]。BCG和LPS肝損傷動物模型簡便易行，且造成的大鼠急性肝損傷與病毒性肝炎發病機制有較大相似，可用于對病毒性爆發性肝炎的研究。

3 酒精誘導大鼠肝纖維化的模型

過度飲酒是人類肝纖維化的重要原因之一，其發病機理和治療方面的研究也被大家所廣泛關注采用，大鼠飲用40%乙醇[10]持續29w。結果表明，肝細胞壞死，肝脂肪變性，肝內形成中心性纖維化。乙醇能增加機體對膽堿需要量，因此有人認為乙醇在伴有營養缺乏時才能進而形成肝硬化，近年來采用液體食物按熱量配制，蛋白18%、脂肪21%、糖61%，其中糖的50%熱量由乙醇代替。實驗1～3年，1/3動物發生肝硬化。液體食物可完全控制食物與酒精的攝入量。缺點為因大鼠天生厭酒，對酒的代謝也較快，劑量過低模型不易成功，劑量過高死亡又增加，死亡率為30%～40%左右，實驗周期長，可造成大鼠急性酒精性肝損傷。

4 膽汁性肝硬化模型

通過結扎、切斷動物的膽總管， 造成膽管完全梗阻、膽汁排出受阻、膽管壓力增高、肝內膽汁淤積， 從而引起肝細胞分泌功能障礙， 導致肝細胞壞死、增生，肝硬化形成，已在大鼠、兔等動物上取得成功。造模方法簡單，操作安全無毒，周期短，大鼠6w左右即形成肝硬化門靜脈高壓。觀察其膽道系統變化情況， 膽總管自狹窄以上呈不同程度擴張， 有的呈現串珠樣擴張。實驗性膽汁性肝纖維化、肝硬化模型， 被認為是一種能模擬人肝纖維化的較理想動物模型。

5 多因素造模

5.1 CCl4加苯巴比妥 1969年首先由Mclean[11]使用于飲水中加入苯巴比妥（350mg/L），加CCl4蒸氣吸入，以后有人改為CCl4灌胃，在飲用苯巴比妥2w后，灌胃，開始劑量為0.04ml，以后按體重增減調整CCl4用量，用此方法縮短了肝硬化形成時間，早期肝纖維化4～6w形成，8～10w形成肝硬化，死亡率仍在40%左右。此模型對可用于研究慢性肝硬化疾病代謝、免疫和生物學方面改變的進展。與單一運用CCl4相比，其方法簡單，縮短建模時間，成模率高且死亡率低。出現病變分期明顯，有助于研究外在因素對肝纖維化進程的干預作用。能造成持續性肝損傷，又不易引起急性肝功能衰竭。

5.2 CCl4加乙醇 乙醇與聯合應用造模已有較多成功報道。兩者相輔相成，乙醇能誘導P450活性從而增加CCl4的肝毒性，在乙醇的致肝脂肪變作用下使用能加速肝細胞壞死，造模時間明顯縮短，同時可減小兩者劑量以降低藥物副反應與動物的不耐受現象。吳孟超[12]報道在大鼠腹腔注射5%起始濃度CCl4色拉油溶液，按0.1ml/kg劑量， 前2w1次/w，第3w開始3d/次，從第3w開始藥物濃度每2次提高2%，劑量維持在0.1ml/kg～0.2ml/kg，將10%乙醇水溶液為唯一飲用水。與乙醇合用使造模時間縮短，藥物劑量減少，降低藥物不良作用。此模型具有動物死亡率低、肝硬化成功率高和造模時間短等優點， 可較成功的模擬人酒精性肝硬化的小結節硬變。

參考文獻：

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編輯/成森