百靈安神片微生物限度檢查方法驗證

摘要：建立百靈安神片的微生物限度檢查方法。方法按照《中國藥典》2010版微生物限度檢查方法進行驗證試驗。結論本品可采用培養基稀釋法檢查細菌數，采用常規法檢查霉菌及酵母菌數，可操作性強。

關鍵詞：百椹安神片；微生物限度檢查；抑菌作用

百靈安神片主要含有制何首烏、酸棗仁（炒）、桑椹、靈芝、百合、知母、丹參、菊花、茯苓、合歡花等多種成分。其中多味中藥材含有抑菌成分，可抑制污染的微生物生長，這就給藥品造成了安全隱患，因此為了更好而有效的保障該藥品的質量，我們根據《中國藥典》2010年版一部附錄[1]的要求對百靈安神片進行了微生物限度檢驗方法驗證，以期獲得更具科學性和準確性的微生物限度檢查方法，從而保證檢驗結果的準確性。

1 藥物與試劑

1.1樣品 百靈安神片（批號130901-1，130901-2，130901-3）石家莊以嶺藥業股份有限公司

1.2 培養基 營養瓊脂培養基（批號：20120802）；改良馬丁瓊脂培養基（批號：121027）；玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號：20121211）；膽鹽乳糖培養基（批號：1204232）；營養肉湯培養基（批號：120913）；改良馬丁培養基（批號：120216）；乳糖膽鹽發酵培養基（批號：20120412）；曙紅亞甲藍瓊脂培養基（批號：1301262）；4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基（批號：120423）；乳糖發酵培養基（1206214）；pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液

來源：中國藥品生物制品檢定所

1.3菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]；枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]；大腸埃希菌[CMCC（B）44102]；白色念珠菌[CMCC（F）98001]；黑曲霉[CMCC（F）98003]；乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50094]，以上培養基和菌種由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.4儀器 生化培養箱：LRH-250F上海一恒儀器有限公司；生物安全柜：美國Frontline；菌落計數器：XK97-A 姜堰市新康醫療器械有限公司；超速離心機：LD4-1.8型 北京京立離心機有限公司。

2 菌液及供試品的制備

2.1菌懸液的制備 ①取經30～35℃培養18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門菌的營養肉湯培養物，10倍稀釋至50～100cfu/ml，備用；②取經23～28℃培養24～48h的白色念珠菌液體培養物，10倍稀釋成50～100cfu/ml，備用；③取經23～28℃培養5～7d的黑曲霉斜面培養物，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每lml含孢子數50～100cfu的孢子懸液，備用；

2.2供試品制備 稱取樣品10g，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml制成1：10的供試液

3細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證

取規定量1：10供試液和上述制備好的陽性對照菌液1ml置平皿中，加入營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基，混合均勻，放置凝固后，置培養箱中培養。每株試驗菌平行制備2個平皿，計數，計算回收率：

3.1平皿法 取1：10供試液1ml/皿

3.2培養基稀釋法 取1：10供試液2ml，每1ml供試液等量分注5個平皿，每5個平皿為一組，傾注營養瓊脂培養基，混勻，凝固后，倒置培養。另外取1ml供試液和白色念珠菌、黑曲霉陽性對照菌液1 ml注入平皿中，做2個平行樣，傾注瓊脂培養基，混勻，凝固后，倒置培養。見圖1。

圖1

3.3計算回收率 試驗組：按上述三種方法取1：10供試液，分別污染50～100cfu/ml的試驗菌株，立即傾注細菌和霉菌培養基，待凝固后，置規定溫度培養3～5d觀察結果：菌液組：測定所加的試驗菌數；供試品對照組：測定供試品的本底菌數；稀釋劑對照組：方法同試驗組。

4結果與分析

見表1～表3。

由表1可知：五株試驗菌適宜稀釋度菌懸液菌落個數都在50～100cfu，因此符合微生限度檢查方法驗證用菌種稀釋度要求。

5控制菌檢查方法驗證

見表4～表6。

從表4、表5、表6可以看出：該供試品控制菌檢查可采用1：10供試液進行控制菌檢查。

本品按照《中國藥典》2010年版一部附錄[1]檢查，由以上試驗結果得：按供試品制備方法稱取10g，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml制成1：10的供試液，細菌限度檢查采用培養基稀釋法（0.2ml/皿），霉菌及酵母菌限度檢查采用常規法；控制菌限度檢查采用常規法。

6討論

中藥制劑含有多種成分，其中部分成分具有一定的抑菌作用，給中成藥微生物含量檢測帶來一定困難。采用常規法進行微生物限度檢查，將影響微生物限度檢查結果的準確性，對患者安全用藥埋下隱患。

通對本品的微生物限度檢查計數方法的驗證可知：建立了百靈安神片的微生物檢查方法，可采用培養基稀釋法（0.2ml/皿）進行細菌限度檢查，可采用常規法進行霉菌及酵母菌限度檢查；采用常規法進行控制菌限度檢查。解決了藥物抑菌成分的存在對微生物限度檢查產生的干擾，能夠真實、客觀地反映藥物的染菌情況，使檢查結果科學、準確、可信。在處方、生產工藝及檢測環境不變的情況下，可按上述驗證后的方法進行本品的微生物限度檢查。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄79-88.

編輯/王海靜