成年大鼠三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元內(nèi)PV和NKCC1、KCC2的共存研究

摘要：目的 觀察PV，NKCC1和KCC2在成年大鼠三叉神經(jīng)中腦核（Vme）神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)。方法 成年SD大鼠，4%多聚甲醛灌注固定，取腦，冷凍切片，PV，NKCC1和KCC2在Vme神經(jīng)元在小腦的免疫熒光雙標(biāo)，免疫熒光顯微鏡觀察。結(jié)果 成年大鼠Vme神經(jīng)元上能觀察到PV和NKCC1陽性神經(jīng)元的表達(dá)，但在Vme神經(jīng)元內(nèi)幾乎觀察不到KCC2 的陽性熒光信號。結(jié)論 NKCC1與PV的共存率很高，而KCC2幾乎沒有表達(dá)。

關(guān)鍵詞：KCC2；NKCC1；小白蛋白；三叉神經(jīng)中腦核；大鼠

陽離子-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體在維持細(xì)胞內(nèi)外Cl-濃度的平衡方面發(fā)揮主要作用。在目前報(bào)道的七種陽離子-Cl- 共轉(zhuǎn)運(yùn)體中，神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)僅表達(dá)KCC1、KCC2、KCC3和NKCC1四種陽離子-Cl-共轉(zhuǎn)運(yùn)體。其中，KCC2負(fù)責(zé)將神經(jīng)元內(nèi)Cl-向外轉(zhuǎn)運(yùn)，而NKCC1則負(fù)責(zé)將胞外的Cl-向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，二者在神經(jīng)元胞膜上構(gòu)成一對平衡體，從而維持神經(jīng)元內(nèi)Cl-濃度的穩(wěn)定和平衡[1～5]。小白蛋白（Parvabumin， PV）是鈣結(jié)合蛋白的一種。有研究表明：發(fā)育過程中，PV特異性地表達(dá)于本體感覺初級傳入神經(jīng)元胞體和突起上。目前，人們已將PV作為本體感覺初級傳入神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物，并被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育學(xué)研究領(lǐng)域[6]。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物和切片制備 雄性SD大鼠，體質(zhì)量230～250g。動物用10%水合氯醛麻醉（0.3～0.5ml/100g），開胸經(jīng)升主動脈向心插管，先灌注100ml生理鹽水隨后以4%冷多聚甲醛（0.1mol/L磷酸緩沖液配制，pH7.4）灌注固定，取整腦后固定6 h，15%和30%蔗糖各12h，30 m冰凍切片，收取含小腦的切片于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）。

1.2免疫熒光化學(xué)反應(yīng) 參照我們以前的方法，主要步驟為：冰凍切片使用5%的正常羊血清室溫孵育30min；第一抗體為兔抗KCC2的多克隆抗體（1：200，Upstate），兔抗NKCC1的多克隆抗體（1：200，Sigma），鼠抗Anti-TH的單克隆抗體（1：200，Sigma）和鼠抗PV的單克隆抗體（1：200，Santa Cruz公司）4℃孵育48h；第二抗體為驢抗鼠（Rhodamine標(biāo)記，Rockson公司，1：200）或驢抗兔（FITC標(biāo)記，Sigma，1：200）的熒光標(biāo)記二抗，在二抗孵育時(shí)加入DAPI藍(lán)色熒光染料（1：40，Sigma）室溫孵育2 h；PBS洗片，貼片，甘油封片，4℃保存?zhèn)溆^察。

2 結(jié)果

成年大鼠Vme 神經(jīng)元內(nèi)能觀察到較強(qiáng)的NKCC1陽性神經(jīng)元（見圖A），Vme神經(jīng)元上能觀察到PV陽性神經(jīng)元（見圖B），但在Vme神經(jīng)元內(nèi)幾乎觀察不到KCC2 的陽性熒光信號（見圖C）。

圖Vme內(nèi)PV，NKCC1和KCC2的表達(dá) A：Vme內(nèi)NKCC1的陽性表達(dá)，B：Vme內(nèi)PV的陽性表達(dá)， C：Vme內(nèi)KCC2幾乎觀察不到表達(dá)，Bar=50m。

3 討論

鉀離子氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體-2（KCC2）是哺乳動物腦內(nèi)神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物，也是介導(dǎo)神經(jīng)元氯離子外排并維持神經(jīng)元胞內(nèi)低氯離子濃度的重要因素，而細(xì)胞膜內(nèi)外的氯離子的濃度梯度則是GABA離子型受體賴以發(fā)揮抑制性作用的前提[7]，因此，KCC2也是離子型GABA受體介導(dǎo)抑制性作用的標(biāo)志；在成年大鼠腦內(nèi)，Vme沒有KCC2表達(dá)，同樣缺少離子型GABA受體介導(dǎo)的抑制性信號系統(tǒng)。陽離子-Cl- 共轉(zhuǎn)運(yùn)體（NKCC1和KCC2）在成年Vme神經(jīng)元的失衡表達(dá)導(dǎo)致Vme神經(jīng)元胞內(nèi)氯離子濃度隨發(fā)育不斷增高，氯離子通道（GABAA受體）開放后，氯離子外流導(dǎo)致去極化發(fā)生。但是，NKCC1、KCC2與PV在Vme的生后發(fā)育過程中是否有共存，其共存的比例是否有變化，而這種相對量上的變化與蛋白表達(dá)水平改變的實(shí)際情況是否相符也無明確的答案。

參考文獻(xiàn)：

[1]Delpire E， Rauchman MI， Beier DR， et al.Molecular cloning and chromosome localization of a putative basolateral Na（+）-K（+）-2Cl- cotransporter from mouse inner medullary collecting duct （mIMCD-3） cells[J].J Biol Chem，1994，269（41）：25677-25683.

[2]Payne JA， Stevenson TJ，Donaldson LF.Molecular characterization of a putative K-Cl cotransporter in rat brain. A neuronal-specific isoform[J].J Biol Chem，1996，271（27）：16245-16252.

[3]Pearson MM， Lu J， Mount DB， et al.Localization of the K（+）-Cl（-） cotransporter， KCC3， in the central and peripheral nervous systems： expression in the choroid plexus， large neurons and white matter tracts[J].Neuroscience，2001，103（2）：481-491.

[4]Plotkin MD KM， Peterson LN. Expression of the Na+-K+-2Cl cotransporter BSC2.[J].Am J Physiol，1997，272（C173-C183.

[5]Williams JR SJ， Kumari VG， et al. The neurons specific K-Cl cotransporter， KCC2.[J].J Biol Chem，1999，274：12656-12664.

[6]Levanon D， Bettoun D， Harris-Cerruti C， et al.The Runx3 transcription factor regulates development and survival of TrkC dorsal root ganglia neurons[J].EMBO J，2002，21（13）：3454-63.

[7]Hyde TM， Lipska BK， Ali T， et al.Expression of GABA signaling molecules KCC2， NKCC1， and GAD1 in cortical development and schizophrenia[J].J Neurosci，2011，31（30）：11088-11095.

編輯/成森