納米銀對牙本質(zhì)表面糞腸球菌生物膜的殺菌作用

摘要：目的 就納米銀對牙本質(zhì)表面糞腸球菌生物膜的殺菌作用進(jìn)行探討。方法 收集80顆無齲壞、完整無缺的前磨牙，將其制成309個牙本質(zhì)片，隨機(jī)分為A組（納米銀組）、B組（次氯酸鈉組）、C組（氯化鈉組），每組有103個樣本。活菌菌落計(jì)數(shù)法檢測糞腸球菌生物膜活菌數(shù)，糞腸球菌生物膜的內(nèi)層活菌、中間層活菌、外層活菌百分比用激光共聚焦顯微鏡來進(jìn)行觀察。結(jié)果隨著0.1%納米銀溶液的處理時間的延長，糞場球菌生物膜活菌的數(shù)量呈現(xiàn)出較為明顯的降低趨勢，到24h之后就沒有活菌出現(xiàn)在生物膜內(nèi)。與此同時，生物膜內(nèi)層、中間層、外層活菌的平均厚度、百分比逐漸減少。結(jié)論 對于糞腸球菌生物膜而言，含量為0.1%的納米銀溶液有著較強(qiáng)的殺菌作用和滲透能力，能夠隨著處理時間的延長而讓殺菌作用增強(qiáng)，最佳的作用時間為處理24h以上。

關(guān)鍵詞：納米銀；牙本質(zhì)表面；糞腸球菌生物膜；殺菌作用

從目前來看，再感染根管中最常檢測到的細(xì)菌為糞腸球菌，它也是主要的致病菌。在這種情況下，尋找出一種有效、安全的抗菌劑，是提高根管治療成功率的重要途徑之一。而納米銀的生物安全性良好、抗菌性能較強(qiáng)，特別適用于作為新型抗菌劑[1]。本文就納米銀對牙本質(zhì)表面糞腸球菌生物膜的殺菌作用進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株 選擇由廣東省微生物研究所提供的糞腸球菌。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 心腦浸出液培養(yǎng)基、含量為5.25%次氯酸鈉溶液、含量為0.1%納米銀溶液、含量為0.9%氯化鈉溶液。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器：FV500-IX81激光共聚焦顯微鏡、B3510E-DTH超聲清洗器、11-1280-250型切片機(jī)、JSM-6330E場發(fā)射掃描電鏡、LI20-2恒溫培養(yǎng)箱、厭氧罐。

1.2方法

1.2.1牙本質(zhì)片的制備及分組 收集80顆無齲壞、完整無缺的前磨牙，將其制成309個牙本質(zhì)片，隨機(jī)分為A組（納米銀組）、B組（次氯酸鈉組）、C組（氯化鈉組），每組有103個樣本。樣本經(jīng)超聲清洗、滅菌之后保存在無菌PBS緩沖液內(nèi)，保存溫度控制在4℃。

1.2.2構(gòu)建牙本質(zhì)表面糞腸球菌生物膜：復(fù)蘇糞腸球菌后，將其放置在BHI液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度控制在37℃，培養(yǎng)時間控制在16h。菌懸液用BHI液體培養(yǎng)基來調(diào)整到1×107CFU/ml，按每孔2ml加到24孔板內(nèi)，每孔1個樣本。

1.2.3糞腸球菌生物膜的表面形態(tài)進(jìn)行掃描電鏡觀察：將A、B、C組樣本都進(jìn)行24h培養(yǎng)，然后從其0h小組中隨機(jī)取3個樣本，將這些樣板上沒有黏附的細(xì)菌用雙蒸水清洗2次以上，再進(jìn)行固定制樣，以此觀察糞腸球菌生物膜的表面形態(tài)。

1.2.4活菌菌落計(jì)數(shù)法檢測糞腸球菌生物膜活菌數(shù) 分別采用含量為5.25%次氯酸鈉溶液、含量為0.1%納米銀溶液、含量為0.9%氯化鈉溶液對樣本進(jìn)行處理，在處理之前的1、6、12、24h時分別從三組中各取10個樣本，雙蒸水清洗2次，然后再將其放入無菌PBS的試管中，培養(yǎng)48h后菌落計(jì)數(shù)。

1.2.5糞腸球菌生物膜的內(nèi)層活菌、中間層活菌、外層活菌百分比用激光共聚焦顯微鏡來進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

隨著0.1%納米銀溶液的處理時間的延長，糞場球菌生物膜活菌的數(shù)量呈現(xiàn)出較為明顯的降低趨勢，到24h之后就沒有活菌出現(xiàn)在生物膜內(nèi)。與此同時，生物膜內(nèi)層、中間層、外層活菌的平均厚度、百分比逐漸減少。生物膜結(jié)構(gòu)被含量為0.1%納米銀溶液處理1h之后，并沒有完全解體，但生物膜內(nèi)層活菌百分比降至（20.8%±4.5%），中間層活菌百分比降至（27.4%±5.6%）；在處理6h之后，生物膜內(nèi)層活菌百分比降至（1.8%±0.9%），中間層活菌百分比降至（2.0%±0.9%）。0.1%納米銀溶液處理12h、24h，生物膜各層活菌百分比與1.313%次氯酸鈉溶液組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但是都要明顯低于0.9%氯化鈉溶液組，存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

隨著根管消毒方法及根管預(yù)備器械的快速發(fā)展，根管治療得到了迅速的提高，但整體成功率仍然只能達(dá)到85%～90%，主要原因在于治療后會出現(xiàn)繼發(fā)性根管內(nèi)感染或者持續(xù)性根管內(nèi)感染，而主要因素在于糞腸球菌的影響。糞腸球菌生物膜表面形態(tài)在掃描電鏡下可以明顯看到：在牙本質(zhì)表面黏附了大量的糞腸球菌，胞外基質(zhì)包裹住了糞腸球菌，并且相互聚集、相互連接，在孔隙、管道等處形成微菌落[2-3]。

納米銀的抗菌機(jī)制與其能夠?qū)⒓?xì)菌的核酸、蛋白質(zhì)予以破壞等有關(guān)。納米銀通過對肽聚糖的生物合成進(jìn)行干擾，以此來對胞壁合成進(jìn)行阻礙，并且還會緊密地結(jié)合細(xì)菌胞膜蛋白質(zhì)，使得細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)出現(xiàn)外滲現(xiàn)象，還可與細(xì)菌DNA堿基進(jìn)行結(jié)合而導(dǎo)致DNA變性；在水溶液中，納米銀還可以形成Ag+來將關(guān)鍵酶進(jìn)行失活代謝，并且形成過氧離子、氫氧自由基、過氧化氫而發(fā)揮出較為明顯的殺菌作用。總之，對于糞腸球菌生物膜而言，含量為0.1%的納米銀溶液有著較強(qiáng)的殺菌作用和滲透能力，能夠隨著處理時間的延長而讓殺菌作用增強(qiáng)，最佳的作用時間為處理24h以上。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zhou HY，Zhang J，Yan RL，et al.Improving the antibacterial property of porcine small intestinal submucosa by nano-silver supplementation：a promising biological material to address the need for contaminated defect repair[J].Annals of Surgery，2011，21（11）：141-145.

[2]閆培芳，姜云濤，梁景平，等.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察堿性環(huán)境對糞腸球菌生物膜的影響[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2011，18（12）：109-113.

[3]莊沛林，高燕，凌均棨，等.三種無機(jī)納米抗菌劑對糞腸球菌的抗菌作用[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2011，20（12）：111-114.編輯/金昊天