冷誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化檸檬的研究

摘要：將包含載體pPtcor∷8Ptcor8∷YFP的農(nóng)桿菌EHA105轉(zhuǎn)入到不抗寒的檸檬中，并對(duì)轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明，再生培養(yǎng)基中的6-BA的濃度，卡那霉素（Kan）濃度以及除草劑（Basta）的濃度對(duì)檸檬的轉(zhuǎn)化效率有明顯影響；再生培養(yǎng)基配方為MT+0.5mg/L6-BA，添加75mg/Lkan或10mg/LBasta時(shí)能夠有效篩選到抗性芽，并獲得了3株轉(zhuǎn)基因檸檬植株，YFP陽(yáng)性率為3.6%。

關(guān)鍵詞：尤力克檸檬；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；遺傳轉(zhuǎn)化；YFP

中圖分類號(hào)：S666.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：l006-060X（2015）05-0074-03

凍害是柑橘生產(chǎn)上的主要災(zāi)害之一，能夠造成大面積減產(chǎn)和嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。目前，人們已開(kāi)始逐步探索利用基因工程手段進(jìn)行植物抗寒育種和有關(guān)生理研究，并利用基因工程手段提高植物的抗寒性。筆者前期從枳巾克隆得到1個(gè)低溫鍛煉相關(guān)基因Ptcor8，該基因在不同柑橘種類巾表達(dá)量不同，在枳巾的表達(dá)量最大，是金柑的3.4倍，柚的4.4倍，甜橙的4.7倍，檸檬的25.5倍，其與柑橘的耐寒力呈正相關(guān)。比較柑橘不同種類中同源基因的啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)枳的啟動(dòng)子pPtcor8與檸檬啟動(dòng)子pClcor8的同源性為88.17%，且枳pPtcor8擁有檸檬pClcor8沒(méi)有的3個(gè)與逆境響應(yīng)相關(guān)的特有調(diào)控元件。筆者構(gòu)建了pPtcor8∷Ptcor8∷YFP融合表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入不抗寒的檸檬中，以探究轉(zhuǎn)基因檸檬植株在低溫脅迫下Ptcor8的表達(dá)量的變化。

柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化通常采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行，并且在甜橙、金柑、枳、葡萄柚中已獲得成功，但在檸檬上報(bào)道較少。提高檸檬轉(zhuǎn)化效率的研究主要集巾在對(duì)再生條件、不定芽的篩選條件等影響因素上。如果得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，可為探究柑橘抗寒的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及農(nóng)桿菌菌株 試驗(yàn)種子為尤力克檸檬種子，果實(shí)產(chǎn)于云南；農(nóng)桿菌EHA105包含載體pPtcor8∷Ptcor8∷YFP，載體T-DNA區(qū)段巾包含枳冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子pPtcor8，枳冷誘導(dǎo)基因Ptcor8，報(bào)告基因YFP。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制 播種培養(yǎng)基為MT，pH 5.7；生根培養(yǎng)基為1/2MT+0.5mg/LNAA+O.1mg/LIBA，pH5.7；重懸液為MT（不加瓊脂）+3.O mg/L 6-BA+20 mg/LAS，pH 5.7；共培培養(yǎng)基為MT+3.OmgL6-BA+20mg/L AS，pH 5.7；LB（Luria-Bertan）培養(yǎng)基為5 g/L酵母提取物（Yeast extract）+10g/L蛋白胨（Tryptone）+10g/L NaCl+15g/L瓊脂，pH 7.O。

1.2 方法

1.2.1 檸檬實(shí)生苗上胚軸的獲得檸檬種子去除外種皮，在超凈工作臺(tái)上用75%酒精消毒1min，再用1%NaCIO溶液消毒20min，然后用無(wú)菌水清洗數(shù)次，將種胚播種于播種培養(yǎng)基上，于26℃條件下，先暗培養(yǎng)20d，再光照培養(yǎng)10d。然后選擇粗約2mm的檸檬實(shí)生苗，將其上胚軸斜切成1cm左右的節(jié)間莖段，用于遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2.2 農(nóng)桿菌侵染檸檬運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將農(nóng)桿菌培養(yǎng)在含100mg/L Kan和25mg/L Rif的LB液體培養(yǎng)基上，28℃、200r/min搖菌24h至OD600為0.5-1.O。常溫12000r/min離心10min后去除上清液，再用重懸液重懸至OD600為0.6左右。外植體侵染15min后轉(zhuǎn)入到共培培養(yǎng)基上19℃暗培養(yǎng)3d后，移入篩選培養(yǎng)基上。

1.2.3 6-BA濃度的篩選為確定適合檸檬實(shí)生苗上胚軸節(jié)間莖段再生的合適培養(yǎng)基，培養(yǎng)基巾的6-BA濃度設(shè)置0mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L等5個(gè)水平，分別將節(jié)間莖段水平放置到不同6-BA濃度的再生培養(yǎng)基巾，先暗培養(yǎng)3d，再置于光照下培養(yǎng)，45d后統(tǒng)計(jì)不定芽再生率。

1.2.4 卡那霉素濃度篩選共培養(yǎng)3d后，將檸檬實(shí)生苗上胚軸節(jié)間莖段水平放置于添加不同濃度Kan的MT+0.5mg/L 6-BA+500mg/L Cef培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基巾的Kan濃度設(shè)置0mg/L、50mg/L、75mg/L和100mg/L4個(gè)水平，設(shè)3次重復(fù)，45d后統(tǒng)計(jì)不定芽再生率。

1.2.5 除草劑濃度篩選共培養(yǎng)3d后，將檸檬實(shí)生苗上胚軸節(jié)間莖段水平放置于添加不同濃度Basta的MT+0.5mg/L 6-BA+500mg/L Cef培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基巾的Basta濃度設(shè)置Omg/L、5mg/L、7.5mg/L、10mgL和15mg/L5個(gè)水平，設(shè)3次重復(fù)，45d后統(tǒng)計(jì)不定芽再生率。

1.2.6 抗性芽的熒光檢測(cè)在超凈工作臺(tái)上，將抗性芽的葉片切下并編號(hào)，立即采用尼康SMZIOOO體式顯微鏡，配合奧林巴斯DP72顯微拍照系統(tǒng)對(duì)抗性芽葉片進(jìn)行熒光檢測(cè)并拍照，之后將抗性芽葉片4℃低溫處理3h后再次進(jìn)行熒光檢測(cè)并拍照。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析選擇莖高0.3cm以上的不定芽，計(jì)算YFP陽(yáng)性率和不定芽再生率，汁算公式如下：

YFP陽(yáng)性率=（YFP陽(yáng)性芽總數(shù)/總節(jié)間莖段數(shù)）×100%

不定芽再生率=（不定芽總數(shù)/節(jié)間莖段總數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA濃度的篩選

選擇MT培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表1，添加6-BA后不定芽的再生能力顯著提高，但當(dāng)6-BA濃度超過(guò)0.5mg/L時(shí)不定芽的再生能力下降，以MT+0.5mgL 6-BA培養(yǎng)基的再生能力最強(qiáng)，其再生率為96.4%，顯著高于其他處理。所以在后續(xù)試驗(yàn)巾均采用MT+0.5mg/L6-BA培養(yǎng)基。

2.2 卡那霉素濃度篩選

以MT+0.5mg/L 6-BA+500mg/L Cef為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度Kan進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表1，添加Kan后明顯抑制了不定芽的再生，當(dāng)濃度升高至75mg/L時(shí)不定芽不再生長(zhǎng)，但節(jié)間莖段依然為綠色，而濃度升高至100mg/L時(shí)檸檬節(jié)間莖段則完全黃化死亡。所以確定適合檸檬轉(zhuǎn)基因植株篩選的Kan濃度為75mg/L。

2.3 除草劑濃度篩選

以MT+0.5mg/L 6-BA+500mg/L Cef為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度Basta進(jìn)行試驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表1，加入低濃度的Basta后檸檬不定芽的再生能力急劇下降，當(dāng)濃度為10mg/L時(shí)不定芽再生能力就被完全抑制，繼續(xù)提高濃度至15 mg/L時(shí)節(jié)間莖段黃化，完全無(wú)愈傷組織的形成。所以確定適合檸檬轉(zhuǎn)基因植株篩選的Basta濃度為10mg/L。

2.4 檸檬抗性芽的檢測(cè)

將得到的抗性芽與非轉(zhuǎn)基因不定芽分別經(jīng)過(guò)常溫（30℃）和低溫（4℃）處理后，發(fā)現(xiàn)只有轉(zhuǎn)基因抗性芽葉片經(jīng)4℃冷處理后才能檢測(cè)到不均勻的黃色熒光，非轉(zhuǎn)基因不定芽經(jīng)常溫、低溫處理，轉(zhuǎn)基因不定芽經(jīng)常溫處理均沒(méi)有黃色熒光。非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因抗性芽經(jīng)常溫處理葉片都沒(méi)有熒光現(xiàn)象，表明pPtcor8基因在常溫表達(dá)量很少或不表達(dá)。轉(zhuǎn)基因抗性芽經(jīng)低溫處理后葉片可檢測(cè)到不均勻的黃色熒光，低溫處理3h可以誘導(dǎo)Ptcor8基因的表達(dá)，所以非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因抗性芽都經(jīng)低溫處理后，只有轉(zhuǎn)基因的抗性芽才有熒光表達(dá)，因此將得到的不定芽進(jìn)行低溫處理后能夠檢測(cè)到不均勻的黃色熒光的不定芽就是轉(zhuǎn)基因抗性不定芽?，F(xiàn)已獲得3株轉(zhuǎn)基因檸檬苗，YFP陽(yáng)性率為3.6%（表2）。

3 小結(jié)與討論

檸檬的轉(zhuǎn)基因研究較少，轉(zhuǎn)化效率也很低，1990年Vardi等利用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體獲得了首例轉(zhuǎn)基因檸檬植株。黃家權(quán)對(duì)檸檬的轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行了研究，并成功的將ICEI基因?qū)霗幟手小１狙芯繀⒖纪跞蜗璧姆椒?，以檸檬上胚軸為轉(zhuǎn)化受體，獲得了較為理想的轉(zhuǎn)化率。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化檸檬的影響因素有很多，如農(nóng)桿菌菌株的不同，外植體的培養(yǎng)方式，共培養(yǎng)的時(shí)間，再生培養(yǎng)方式，以及菌液的濃度等，其巾尤為關(guān)鍵的是再生條件以及篩選壓的選擇。再生培養(yǎng)基巾需要加入一定濃度的抗生素，理論上較高濃度的抗生素有利于篩選出抗性不定芽，但是也會(huì)強(qiáng)烈抑制不定芽的產(chǎn)生，所以選擇合適濃度的抗生素是能否得到抗性芽的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)對(duì)再生培養(yǎng)基巾的6-BA，卡那霉素以及除草劑濃度進(jìn)行了篩選，得出最佳的再生培養(yǎng)基為MT+0.5mg/L 6-BA，添加75mg/L Kan或10mg/LBasta。

對(duì)得到的抗性芽進(jìn)行熒光檢測(cè)，只有轉(zhuǎn)基因不定芽經(jīng)4℃低溫處理后有熒光現(xiàn)象，驗(yàn)證了Ptcor8基因的啟動(dòng)子在常溫下不表達(dá)，經(jīng)低溫處理后才能表達(dá)，最后成功的將pPtcor8∷Ptcor8∷YFP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到檸檬巾，YFP陽(yáng)性率為3.6%，獲得了3株轉(zhuǎn)基因檸檬植株，為驗(yàn)證柑橘抗寒的相關(guān)基因和啟動(dòng)子奠定了基礎(chǔ)。