環境毒理學實驗中小球藻EC—50值測定的影響研究

摘 要：該文擬以水體常見的污染物苯胺為測試毒物，以自然水體常見的小球藻為測試藻種，擬定光照強度、光暗比、溫度、容器大小等作為條件因子，研究其對半效應濃度（EC50）值測定的影響。結果顯示：苯胺對小球藻的毒性在不同條件下相差甚遠，其EC50值在12～89 mg·L-1之間；而且苯胺對小球藻的EC50值隨著溫度的增加、光強的增強、培養容器的增大而減小，隨著光周期的延長而增大。經過極差分析顯示，對其EC50值影響最大的是溫度。

關鍵詞：EC50值 小球藻 苯胺 培養條件

中圖分類號：X17 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2015）10（b）-0182-03

作為水生生態系統中的初級生產者，藻類對于維持生態系統的平衡和穩定起著極其重要的作用。在水生生態毒理研究中，單細胞綠藻往往因其周期短，易于分離、培養和可以直接觀察細胞水平上的中毒癥狀等優點，是較為理想的實驗材料，常用作急性毒性測定[1-2]，因此，也被包括在本科生毒理學實驗的教學大綱中。但根據目前的文獻資料以及我們的目前的實驗結果表明，藻類EC-50值在不同實驗室測定的結果相差非常大，背后的一個重要原因可能是因為實驗條件的不同。如同是來自武漢水生所的蛋白核小球藻，同是五氯酚對它的生長抑制實驗，南開大學的黃國蘭研究組在25 ℃，光照強度為4000 lux，光暗比=12 h∶12 h條件下得出五氯酚對蛋白核小球藻96 h EC-50值是3.49 mg/L[3]；而我們在23 ℃，光強為3000 lux，光暗比=16 h∶8 h條件下得出，即使在10 mg/L五氯酚濃度下，96 h蛋白核小球藻的抑制率才達到30%左右[4]。同是苯胺對小球藻的生長抑制實驗，殷震育等人的結果表明，苯胺對小球藻24～96 h的EC-50值為1～11.7 mg/L[5]；而我們的毒理學實驗課的結果卻表明，苯胺96 h的EC-50值約17 mg/L，針對不同實驗條件下如此大的實驗結果，教師、學生倍感疑惑。因此，搞清楚其中的原委，即研究各種條件因子對藻EC-50值測定的影響程度，不僅會大大改善課題實驗教學的效果，而且對完善藻EC-50值來評價化合物毒性等級的技術規范方面也是一個重要的參考。

鑒于此，該項目擬以水體常見的污染物苯胺為測試毒物，以自然水體常見的小球藻為測試藻種，擬定光照強度、光暗比、溫度、容器大小等作為條件因子，研究其對EC50值測定的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑、儀器及實驗材料

苯胺（分析純）、SE培養基（見表1）、光照培養箱、分光光度計、顯微鏡、血球計數板、小球藻藻種（由中國科學院水生生物研究所提供）。

1.2 實驗條件

擬定光照強度（4000 lux）、光暗比（14 h∶10 h）、溫度（25 ℃）作為藻EC-50值測試的基本條件，觀察某條件因子對藻EC-50值測定影響時，在基準條件的基礎上每次變換一個條件進行。具體（如表2）。

上述各條件的實驗苯胺濃度均設置為0、0.1、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 mg/L，共計7個濃度，每個濃度3個平行，接種密度5×105個/mL。在上述條件下培養96 h后，用顯微鏡計數。

1.3 數據處理

參照徐曉白等人編著的《典型化學污染物在環境中的變化及生態效應》中相關方法[6]計算EC50。

2 結果與討論

2.1 溫度對苯胺EC50-96h測定的影響

從圖1可見，隨著溫度的增強（從20°增加到30°），EC50-96h值迅速減小（從89.0 mg/L降到12.0 mg/L），即隨著溫度的增加，苯胺對小球藻的毒性增加。可見，溫度對EC50值的測定具有非常大的影響，這可能是由于溫度增加了，藻類的新陳代謝也相應的增加，從而加速對外界環境各種物質包括污染物的攝取，從而導致體內毒素積累，毒性增加。

2.2 光強對EC50-96 h測定的影響

隨著光照強度的增加，EC50-96 h值逐漸減小，即增加光強，可增加苯胺對小球藻的毒性。這有兩種可能：（1）在強光刺激下，小球藻細胞的通透性增加，導致苯胺進入藻體的速度增加，從而毒性增加；（2）在過分光強條件下，小球的生理狀態有所改變，即對抗逆境（如高濃度苯胺環境）的能力有所下降，導致毒性增加。具體原因有待進一步探索。

2.3 光周期對EC50-96 h測定的影響

光周期對EC50-96 h值也有影響，光暗比越大，EC50-96 h值越大，即毒性越小。這說明苯胺對小球藻的毒性作用主要發生在暗期，這可能是由于在光期光合作用的存在，小球藻體內產生了抵抗苯胺毒性的物質，而到了暗期，光合作用結束，抵抗能力則相應減少。

2.4 容器大小對EC50-96 h測定的影響

從圖1可知，容器大小對EC50-96 h測定也存在影響，苯胺對小球藻的EC50-96 h，大容器（250 mL）測定值要比小容器（100 mL）小，即大容器培養條件下苯胺對小球藻具有更大的毒性。這可能是小容器比表面積較大，單位體積的藻溶液所受的光照較大容器多，因此，在相同接種密度下，小容器中藻的增長速度較大容器快（對照組小容器藻的增長速率0.50×106/d；對照組大容器藻的增長速率0.34×106/d），從而小容器中單位細胞所受的毒物量相對少了，則毒性也相應低了。

2.5 溫度、光強、光周期、容器大小對EC50-96 h影響程度的比較

雖然溫度、光強、光周期、容器大小對EC50-96 h值的測定都有影響，但究竟是哪個影響最大，并不知曉。為此我們對上述正交實驗結果進行極差分析，過程及結果如表3所示。從表3中的R值可見，苯胺對小球藻EC50值測定影響最大的是溫度（77.05），而光強（25.6）、光暗比（18.95）、容器大小（16.9）則相對影響不是那么大。因此，在今后的實驗教學或者科研性的毒性測試中，要特別注意溫度的控制，其他條件也要盡量統一，這樣不同物質之間的毒性才有可比性。

3 結論

溫度、光強、光周期、容器對EC50-96h值的測定都有不同程度影響，但影響最大的是溫度。

參考文獻

[1]孟紫強.環境毒理學基礎[M].高等教育出版社，2003.

[2]孔志明，楊柳燕，尹大強，等.現代環境生物學實驗技術與方法[M].中國環境科學出版社，2005.

[3]Huang，G.L.，Mao，Y.X.，Headley，J.V.，Sun，H.W.，Temporal changes in the toxicity of pentachlorophenol to Chlorella pyrenidosa algae[J].J.Environ.Sci.Health，Part B，2003（38）：551-559.

[4]Hong，H.C.，Zhou，H.Y.，Lan，C.Y.，Liang，Y.Pentachlorophenol induced physiological biochemical changes in Chlorella pyrenoidosa culture[J].Chemosphere，2010（81）：1184-1188.

[5]殷震育，于玲紅，李玉梅.苯酚、苯胺對黃河水中藻類的急性毒性研究[J].人民黃河，2008（11）：54-55.

[6]徐曉白，戴樹桂，黃玉瑤.典型化學污染物在環境中的變化及生態效應[M].北京：科學出版社，1998：373-374.