SDF—1在胃癌中的表達變化及其臨床意義

摘要：目的 通過檢測SDF-1在胃癌和癌旁正常組織中的表達，分析其與患者臨床病理特點的關系，進而推論SDF-1在胃癌發生發展過程中可能扮演的角色。方法 用RT-PCR和免疫組化法檢測52例診斷明確的胃癌患者的SDF-1在胃癌組織以及癌旁正常組織中的表達情況，并結合臨床病理特點進行統計分析。結果 免疫組化方法測得，胃癌組織中SDF-1蛋白的陽性率顯著高于癌旁組織，分別為94.2%和5.8%，差異有統計學意義（P<0.05）；RT-PCR測得SDF-1基因在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義（P<0.05）。胃癌組織中SDF-1基因的表達在HP陽性胃癌患者中的表達顯著高于HP陰性胃癌患者；在分期較晚、浸潤深度越深、淋巴結轉移越多及分化程度較差的胃癌患者中的表達顯著高于分期早，浸潤深度越淺、淋巴結轉移越少以及分化程度較好的胃癌患者（P均<0.05）；其表達水平與腫瘤位置、患者性別、年齡以及術前外周血CEA、CA19-9水平不相關（P均>0.05）。結論 SDF-1基因和蛋白在胃癌組織中的表達均顯著高于癌旁組織，提示其可能在胃癌的發生過程中作為一種致癌基因扮演著重要角色；HP感染增強SDF-1的致癌作用，SDF-1可以作為判斷胃癌患者預后的指標，但不能作為推測復發的指標。

關鍵詞：SDF-1；胃癌；病理學特征；幽門螺旋桿菌

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，全球每年有超過90萬的新確診病例和大約70萬的胃癌患者死亡[1]。在我國其發病率和死亡率占各種消化系統惡性腫瘤之首。從基因水平研究胃癌的發生發展對提高胃癌的治療效果具有重要意義。基質細胞衍生因子1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1，又稱CXCL12），是CXC趨化因子家族的成員，其與受體CXCR4結合參與機體造血、干細胞生成、白細胞浸潤、神經、血管和心臟的形成以及HIV感染等一系列生理病理過程。近年來研究發現，SDF-1與多種腫瘤發生、浸潤、轉移有關[2-4]。本研究采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）以及免疫組織化學的方法，檢測胃癌組織和癌旁正常組織中SDF-1的表達，探討SDF-1與相關臨床病理指標的相關性，研究其與胃癌增殖、浸潤、轉移的關系，判斷SDF-1基因能否作為預后及推測復發的指標。

1資料與方法

1.1一般資料 收集2011 年4～7月川北醫學院附屬醫院胃腸外科的胃癌手術標本（包括癌組織和癌旁6 cm以上胃黏膜組織）52例，含男41例，女11例；年齡31～79歲，平均（58.6±11.7）歲。據NCCN 2012 版胃癌TNM 分期標準[5]：Ⅰ期15 例，Ⅱ期8 例，Ⅲ期19 例，Ⅳ期10 例。據NCCN 2012 版胃癌淋巴結轉移分級標準[5]：N0 20 例，N1 10 例，N2 14 例，N3 8 例。腫瘤分化程度：高分化癌2 例，中分化癌14 例，低分化癌36 例。腫瘤部位：胃上1/3者13例，中1/3者14例，下1/3者25例。據UICC1997年公布的胃癌TNM分期法[6]，T1：10例，T2：10例，T3：32例。所有病例均經術前胃鏡活檢和術后病理學檢查證實為胃癌，且近期均未服用過抗幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，HP）藥物或行放化療治療。

1.2主要試劑與儀器 TRNzol，天根生化科技（北京）有限公司；逆轉錄試劑盒及RT-PCR 試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；免疫組織化學SDF-1一抗（單克隆，鼠抗人）及免疫組織化學二抗試劑盒，ABCAM 公司；DAB 試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司；定量PCR 儀，ABI 公司。

1.3 HP檢測 14C-尿素呼吸試驗兼簡單、快速以及價廉于一體，靈敏度>95%，特異度高于90%，為HP感染的一線定性診斷方法[7]。本研究術前即采用14C-尿素呼吸試驗的方法檢測患者HP值，<100 dpm為陰性，≥100 dpm為陽性。有11例患者因胃食管結合部完全梗阻而未做此項檢查。

1.4 RT-PCR 法檢測SDF-1 基因的表達

1.4.1總RNA的提取和逆轉錄 剪取一定量的組織，用液氮研成粉末后按比例加入TRNzol，按TRNzol說明書進行總RNA的提取，用焦炭酸二乙酯處理后的水（簡稱DEPC水）溶解RNA，并檢測RNA的質量，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。

1.4.2 RT-PCR 檢測SDF-1和β-actin引物由上海Invitrogen公司合成。引物序列及產物大小，見表1。反應體系及擴增條件見表1。2-△Ct為基因的相對表達量，其中△CT 為RT-PCR 檢測SDF-1 所得的CT 值與檢測β-actin 所得的CT 值之差。△CT 值越高，基因表達越低。

1.5免疫組織化學法檢測SDF-1蛋白的表達 切烤片，依次置二甲苯溶液、無水乙醇、85% 乙醇、75% 乙醇，0.01MPBs（PH7.4）漂洗；3%過氧化氫溶液室溫避光封閉；置枸櫞酸溶液進行高溫抗原修復；滴加一抗，二抗；滴加DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗藍化；吹干，封片。用非腫瘤患者正常胃黏膜組織作為陽性對照，用PBS 代替一抗作為陰性對照[8]。

陽性結果判定根據以下兩方面的總分進行判斷：①選染色均勻的陽性表達腫瘤區域，5個高倍視野計數陽性細胞，以陽性細胞所占百分比為五級計分：陽性細胞率<5%為0分；陽性細胞率5%～25%為1分；陽性細胞率26%～50%為2分；陽性細胞率51%～75%為3分；陽性細胞率>75%為4分。②按染色強度來分：不著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。兩種評分相加，0～1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為陽性（++），6～7分為強陽性（+++），以上方法均由兩名病理醫師采用雙盲法獨立檢測，取平均值[9]。

1.6統計學方法 采用SPSS 17.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，胃癌與癌旁組織的△Ct值比較采用配對樣本t檢驗，按臨床病理學特征分組后各組癌組織的△Ct 值兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；免疫組織化學結果采用配對χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1 RT-PCR 檢測SDF-1在胃癌和癌旁組織中的表達情況 SDF-1基因在胃癌組織中的表達高于癌旁組織，其△Ct 值之差為（-10.74±1.87），差異有統計學意義（t=42.50，P<0.01），見圖1。

圖1 RT-PCR檢測SDF-1基因在癌組織及癌旁組織中的表達情況

2.2免疫組織化學檢測結果 SDF-1蛋白在胃癌組織中的表達陽性率為 94.2%（49/52），明顯高于其在癌旁正常組織中的表達陽性率5.8%（3/52），差異有統計學意義（P<0.01），見表2、圖2。

圖2 免疫組化結果：A胃癌組織 陽性（x200），B 癌旁組織 陰性（x200）

2.3胃癌組織中SDF-1基因表達與其臨床病理學特征的關系 不同腫瘤分期、分化及淋巴結轉移程度、浸潤深度以及HP陽性與陰性的胃癌患者，胃癌組織中SDF-1 基因的表達差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。不同性別、年齡、腫瘤部位以及術前外周血CEA 和CA19-9陽性與陰性的胃癌患者，胃癌組織中SDF-1 基因的表達差異均無統計學意義（P>0.05），見表4。

3討論

SDF-1由Tashiro首先在P6系小鼠骨髓基質細胞分泌的細胞因子中發現，通過表達克隆的方法分離得到它的cDNA[10]。其基因位于10 號染色體長臂上，SDF-1cDNA長1776bp，屬于趨化因CXC受體家族，編碼的受體為CXCR4，是與G 蛋白耦聯的部位。國外學者[11]首先發現其在卵巢癌細胞中高表達，后來在乳腺癌[2]、前列腺癌[3]、宮頸癌[12]、肺癌[13]等研究中發現，SDF-1的表達與腫瘤的生長、增殖、侵襲轉移有關。SDF-1 廣泛表達于多種細胞和組織中，包括免疫細胞、腦、心臟、腎、肝、肺和脾，在免疫系統、循環系統及中樞神經系統的發育中起著至關重要的作用[10，14]。SDF-1 調控人體多種生理病理過程，包括心臟和神經元的發育、血管發生、干細胞遷移、新生血管形成、凋亡和腫瘤發生。SDF-1與其受體CXCR4 的結構和相互作用機制是發揮其病理、生理功能的基礎。

有研究[15]發現，SDF-1的過表達通過對間質肌纖維母細胞和上皮細胞的祖細胞擴增，誘導胃黏膜不典型增生。從癌旁胃黏膜→胃癌前病變→早期胃癌→進展期胃癌，胃黏膜組織中SDF-1的表達水平逐漸升高，可見其表達變化貫穿胃組織癌變的全過程，在胃癌的發生、發展過程中扮演著重要角色。如果能夠通過研究發現它與胃癌某些病理學特征的關系，那么術前胃鏡下活檢將有助于對腫瘤的初步評估，指導臨床治療，然而類似的研究在國內很少。SDF-1的表達與胃癌外周血CEA 和CA19-9 水平及HP值是否有關，目前國內外研究尚無報道，其與胃癌患者病理學特征如臨床分期、淋巴結轉移以及與患者性別、年齡的關系，目前國內研究也較少，值得我們進一步深入研究探討。本研究采用RT-PCR 和免疫組織化學的方法分別從基因和蛋白質兩個水平檢測SDF-1在胃癌和癌旁正常組織中的表達，并結合患者的臨床資料和腫瘤病理學特征進行比較分析，以期探索上述問題。

本研究結果顯示，無論在基因還是蛋白質水平，胃癌組織SDF-1的表達均高于癌旁正常組織，從而印證了它是一種致癌基因[2-3，11-13]的結論。Shibata[15]的研究發現當SDF-1轉基因小鼠與感染幽門螺桿菌的貓鼠雜交后在致胃癌作用上有協同效應，本研究結果證實SDF-1基因與HP感染與胃癌的發生發展呈正相關，且與腫瘤浸潤深度與分期正相關，這與Ishigami[16]的研究結論一致。陳友權[17]的研究表明SDF-1的表達與腫瘤的組織學分級呈正相關，本研究結果顯示SDF-1的表達在低分化程度的胃癌患者中顯著高于中高分化程度的胃癌患者；本組結果亦提示SDF-1基因表達與淋巴結的轉移程度相關而與腫瘤位置無關，這與Iwasa[4]的研究結果吻合。另外，本研究還發現，胃癌患者癌組織中SDF-1基因的表達與其性別和年齡均無關，提示SDF-1基因的表達無性別差異，也不會隨著年齡的增加而增減。CEA和CA19-9檢測值可用于胃癌患者復發的評估[18]，本研究發現胃癌組織中SDF-1基因的表達與患者術前外周血CEA 和CA19-9 的水平均無關。因此推測SDF-不能作為推測復發的指標。我們下一步需要隨訪本實驗胃癌患者的復發情況，再分析SDF-1基因與患者復發的關系，進一步證實SDF-1基因可用于胃癌患者復發的評估。另外， SDF-1基因在胃癌發生、發展過程中的作用機理目前尚無明確的定論，有待進一步深入的研究。

參考文獻：

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編輯/張燕