HIF1 和COX2 在糖尿病腎病中的作用和機(jī)制

摘要：目的 探討2型糖尿病腎病患者血漿中HIF1 和COX2水平的變化及其在2型糖尿病腎病中的作用機(jī)制。方法 收入45例2型糖尿病患者及37例年齡/性別匹配的健康志愿者，檢測(cè)其血漿中HIF1 和COX2的表達(dá)水平。另外，建立2型糖尿病腎病的大鼠模型，其中正常組和對(duì)照組各15只，分別檢測(cè)2型糖尿病腎病大鼠血液和腎臟中HIF1 和COX2的表達(dá)水平。結(jié)果 糖尿病患者血清水平HIF1 （75.58±7.84）ng/mL及COX2水平（53.59±8.60）pg/mL均顯著高于對(duì)照組[HIF1 （1.59±0.27）ng/mL，COX2（1.71±0.61）pg/mL]（P<0.05）；HIF1 和COX2之間存在正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.975，P<0.05）。與正常對(duì)照組比較，糖尿病大鼠血、尿HIF1 和COX2水平均增高；Western blotting 結(jié)果顯示，糖尿病大鼠腎病組織中HIF1 和COX2表達(dá)量明顯上調(diào)。結(jié)論 2型糖尿病患者和糖尿病腎病的大鼠模型血清中HIF1 和COX2 表達(dá)量都明顯上調(diào)，表明二者在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中都起著重要作用。

關(guān)鍵詞：糖尿病腎臟病；低氧誘導(dǎo)因子；環(huán)氧合酶

糖尿病腎臟病（DKD）是糖尿病微血管的主要并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明[1]，早期研究表明腎臟毛細(xì)血管間腎小球硬化造成蛋白尿排泄和濾過(guò)的異常引起病變[2]。近年的研究顯示HIF1 及其下游蛋白COX2參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，多項(xiàng)研究表明高表達(dá)的HIF1 及COX2參與了多種腫瘤形成過(guò)程中的新的血管生成[3，4]。而糖尿病腎臟病的產(chǎn)生也是由于血管發(fā)生病變引起，我們推測(cè)HIF1 及COX2也可以參與調(diào)節(jié)糖尿病腎臟病。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)2型糖尿病患者和糖尿病腎病的大鼠模型中HIF1 和COX2的表達(dá)情況，來(lái)探討二者在糖尿病腎病中的作用及機(jī)制。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1一般授試者 研究中共收入82例研究對(duì)象，45例為2型糖尿病（DM）患者，男24例，女21例，年齡50～79歲，平均年齡（64.55±10.30）歲；糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考1999年世界衛(wèi)生組織制定的標(biāo)準(zhǔn)，即空腹血糖>7.0mmol/L，餐后2h或糖耐量試驗(yàn)2h> 1.lmmol/L。37例為健康志愿者，男19例，女18例，年齡48～78歲，平均年齡（62.22±11.18）歲。

1.1.2糖尿病腎病大鼠模型 清潔級(jí)近交系雄性Wister大鼠30只，每籠5只，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，12h光照周期。隨機(jī)分為糖尿病模型組和正常對(duì)照組，每組15只。糖尿病模型組給予單次左下腹腔注射60mg/kg的鏈尿佐菌素（STZ），注射后第3d測(cè)尾靜脈血糖，若血糖低于<11.1mmol/L者被排除；正常對(duì)照組腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液，所有動(dòng)物于8w處死。

1.2方法

1.2.1 標(biāo)本處理 ①受試者在空腹12 h后于清晨采集外周靜脈血5ml，加入肝素鋰抗凝離心管中，4℃ 3000 r/min離心10 min，取上清液待檢。②大鼠模型于實(shí)驗(yàn)第8w麻醉后剪斷頸動(dòng)脈取全血6～8ml，離心分離血清，待測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。并處死動(dòng)物，迅速取出腎臟，待檢。處死前夜大鼠禁食過(guò)夜，自由飲水。

1.2.2檢測(cè)方法 ①血液中COX-2檢測(cè)采用Zymed公司提供的人COX2試劑盒進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)，以ng/mL為濃度單位。VEGF檢測(cè)同樣采用（ELISA）測(cè)定，試劑盒由Raybiotech公司生產(chǎn)，嚴(yán)格按照試劑盒程序操作，以pg/mL為濃度單位，每份標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)并取平均值作為分析數(shù)據(jù)。②Western Blot檢測(cè)大鼠腎臟組織中HIF1 和COX2的表達(dá)量。BCA（碧云天公司）法測(cè)定各樣品蛋白質(zhì)含量，Western Blot分析結(jié)果，選用GAPDH做內(nèi)參。其中HIF1 、COX2及GAPDH的抗體都來(lái)源于CST公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（mean±SE），采用SPSS17. 0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。組間比較方法采用單因素方差分析，相關(guān)性分析行Pearson統(tǒng)計(jì)，相關(guān)系數(shù)用r表示。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 受試者一般資料比較 糖尿病組患者糖化血紅蛋白、尿蛋白及血肌酐水平顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2 受試者血清中HIF1 和COX2表達(dá)水平變化比較 糖尿病組患者血清HIF1 和COX2水平均高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HIF1 與COX2之間存在正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.963，P<0.01），HIF1 及COX2與患者尿蛋白之間均存在正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HIF1 與尿蛋白r=0.746，P<0.01； COX-2與尿蛋白r=0.782，P<0.01）HIF1α及COX-2與患者血肌酐之間均存在正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HIF1 與血肌酐r=0.683，P<0.01；COX-2與血肌酐r=0.719，P<0.01），見(jiàn)表1～2。

2.3各組大鼠模型生化指標(biāo)變化比較 糖尿病組大鼠血糖顯著高于對(duì)照組，血糖含量最高可達(dá)到30 mmol/L，血清總膽固醇（Tch）也顯著高于正常對(duì)照組，該結(jié)果表明我們已成功構(gòu)建了糖尿病大鼠模型，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠模型生化指標(biāo)變化比較（ x±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05

2.4各組大鼠血中HIF1 和COX2表達(dá)水平變化比較 與正常對(duì)照組比較，糖尿病大鼠血中HIF1 和COX2水平顯著提高，并且HIF1 水平高的大鼠中COX2表達(dá)也顯著升高，二者表達(dá)量呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

表4 正常對(duì)照組、DM組大鼠血中 HIF1α及COX2水平比較（ x±s）

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05

2.5各組大鼠腎臟組織中HIF1 和COX2蛋白印跡結(jié)果比較 Western-blot檢測(cè)腎組織HIF1 和COX2蛋白表達(dá)比較：HIF1 和COX2表達(dá)量在糖尿病組大鼠中顯著升高。見(jiàn)圖1。

圖1

3討論

糖尿病腎臟病是糖尿病常見(jiàn)而又嚴(yán)重的并發(fā)癥，預(yù)后較差。糖尿病腎病目前確切發(fā)生機(jī)制仍未完全清楚。大量研究證明， 遺傳因素、血流動(dòng)力學(xué)、糖與脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)等共同長(zhǎng)期作用是引起糖尿病腎臟病的主要原因[5]。

HIF1α是由于組織或細(xì)胞缺氧而誘導(dǎo)產(chǎn)生，它是誘導(dǎo)低氧基因和修復(fù)細(xì)胞氧內(nèi)環(huán)境的一個(gè)核心調(diào)節(jié)因子，可以參與多種腫瘤的生長(zhǎng)[6]。COX-2主要存在于在內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞，可受活性氧中間產(chǎn)物誘導(dǎo)性表達(dá)，并參與氧化應(yīng)激過(guò)程，使活性氧的損傷作用反饋性增大，其產(chǎn)物在炎癥等病理過(guò)程中起重要作用，促進(jìn)糖尿病大血管病變的發(fā)生[7]。研究表明，高糖條件下可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體活性氧簇（ROS）明顯增加，通過(guò)激活HIF1α使COX-2啟動(dòng)子的活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致COX-2表達(dá)增加，可能參與了血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增生，并進(jìn)一步損傷內(nèi)皮細(xì)胞，參與炎癥反應(yīng)及微血管結(jié)構(gòu)病變[8]。大量研究證實(shí)它是一種可誘導(dǎo)的、對(duì)糖皮質(zhì)激素敏感的酶，靜息時(shí)不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到各種刺激時(shí)迅速合成，表達(dá)增加，是炎癥過(guò)程中一個(gè)重要的誘導(dǎo)酶，COX-2與腎血流動(dòng)力學(xué)及水鹽代謝關(guān)系密切，參與腎臟球管反饋及腎素的釋放。另外，COX-2可以促進(jìn)PGE2的產(chǎn)生，PGE2可以介導(dǎo)腎臟次全切除后所引起的腎臟功能改變和腎小球損傷，誘導(dǎo)糖尿病腎病的發(fā)生[9]。本研究結(jié)果顯示，在糖尿病患者及糖尿病大鼠血清中存在水平明顯升高的HIF1α和COX2，顯示糖尿病患者存在全身性的慢性炎癥，并且這種慢性炎癥與患者的尿蛋白水平及血肌酐水平之間存在明顯相關(guān)性，HIF1α被誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)一步激活下游的COX2表達(dá)，COX2主要通過(guò)誘導(dǎo)PGE2的產(chǎn)生來(lái)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，它可以促進(jìn)腎小球內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞遷移或活性增加，促進(jìn)腎小球硬化，可誘導(dǎo)遠(yuǎn)端腎小管上皮細(xì)胞的肥大，促進(jìn)蛋白的合成，從而介導(dǎo)DN早期腎小球、腎小管的肥大，對(duì)早期DN結(jié)構(gòu)產(chǎn)生改變，最終導(dǎo)致腎小球功能及通透性改變并導(dǎo)致持續(xù)的蛋白尿，其結(jié)果是導(dǎo)致進(jìn)行性的腎損害，并出現(xiàn)腎小球?yàn)V過(guò)率隨病程逐漸下降，出現(xiàn)血肌酐水平的上升。控制糖尿病患者的全身慢性炎癥過(guò)程及抑制HIF1α、COX2表達(dá)可能有助于延緩腎小球病變。

目前，HIF1α及COX-2抑制劑正越來(lái)越多地應(yīng)用于腫瘤性疾病的治療過(guò)程中，本研究顯示此類抑制劑治療可能作為一種潛在的控制糖尿病腎病患者蛋白尿水平的手段。但是，將此類抑制劑應(yīng)用到臨床中還存在一定的風(fēng)險(xiǎn)，還需要更全面的基礎(chǔ)和臨床研究來(lái)提供理論依據(jù)。

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編輯/康潔