HPLC法測(cè)定鹽酸瑞伐拉贊片有關(guān)物質(zhì)

摘要：目的 建立測(cè)定鹽酸瑞伐拉贊片有關(guān)物質(zhì)的HPLC法。方法 選用C18柱（150mm×4.6mm；Φ5μm），柱溫：35℃；流動(dòng)相：乙腈：甲醇：水：三乙胺（37：37：26：0.05）。流速：1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：271nm。結(jié)果 鹽酸瑞伐拉贊與有關(guān)物質(zhì)分離良好，最低檢測(cè)限0.8ng。結(jié)論 本方法操作簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，耐用性好。

關(guān)鍵詞：鹽酸瑞伐拉贊片；高相液相色譜法；有關(guān)物質(zhì)

瑞伐拉贊為酸泵拮抗劑，能迅速穿過(guò)胃壁細(xì)胞膜，聚積在強(qiáng)酸性分泌小管中，轉(zhuǎn)化為次磺酰胺類化合物，與H+、 K+-ATP酶的巰基共價(jià)結(jié)合，形成二硫鍵，使質(zhì)子泵失活，從而抑制中樞或外周介導(dǎo)的胃酸分泌。與傳統(tǒng)質(zhì)子泵拮抗劑（PPI）不同，瑞伐拉贊適度抑制胃酸分泌不足，可逆調(diào)節(jié)胃酸分泌量以適應(yīng)胃腸道消化需要，具有可逆性調(diào)控的特點(diǎn)，且安全性和耐受性良好，累積治愈率為93.0%。有關(guān)物質(zhì)檢查是檢測(cè)藥品純度和評(píng)價(jià)藥品穩(wěn)定性的重要檢測(cè)項(xiàng)目。然而，有關(guān)鹽酸瑞伐拉贊的文獻(xiàn)報(bào)道較少，目前更是尚無(wú)其有關(guān)物質(zhì)研究的報(bào)道。本文通過(guò)高效液相色譜法對(duì)鹽酸瑞伐拉贊有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，詳細(xì)報(bào)道其研究過(guò)程，以加深對(duì)該項(xiàng)目的認(rèn)識(shí)，保證藥品的安全有效。

1 儀器與試劑

儀器：島津高效液相色譜儀10A型。鹽酸瑞伐拉贊對(duì)照品（自制精制品，批號(hào)：100406）；鹽酸瑞伐拉贊片參比制劑（韓國(guó)Yuhan公司）；鹽酸瑞伐拉贊片（自制，規(guī)格：0.2g，批號(hào)：100726、100729、100730）；水為純凈水；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為ACE C18柱（150mm×4.6mm；Φ5μm），柱溫：35℃；流動(dòng)相：乙腈：甲醇：水：三乙胺（37：37：26：0.05）。流速：1.0ml/min，進(jìn)樣量20μl，檢測(cè)波長(zhǎng)：271nm。

2.2系統(tǒng)適用性

2.2.1酸、堿、熱、光及氧化破壞試驗(yàn) 取本品5片研細(xì)，精密稱取約0.65g置100ml量瓶中，加流動(dòng)相超聲溶解，作為供試品母液。取本品空白輔料適量研細(xì)，精密稱取約0.45g，置100ml量瓶中，加流動(dòng)相超聲溶解，作為輔料空白母液（用前搖勻）。

2.2.1.1未破壞溶液 取供試品母液1ml，置10ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋置刻度、搖勻、過(guò)濾、取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.2熱破壞溶液 分別量取供試品母液及輔料空白母液5ml分別置試管中；置沸水浴中加熱5h，冷卻至室溫，分別轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度、搖勻、分別過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.3酸破壞溶液及酸空白溶液的制備：量取供試品母液1ml置10ml試管中，加1mol/L鹽酸溶液2ml；另取10ml試管加輔料母液1ml，加1mol/L鹽酸溶液2ml；同置沸水浴中加熱30min，放冷，再分別加1mol/L氫氧化鈉溶液2ml，分別轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度、搖勻、分別過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.4堿破壞溶液及堿空白溶液的制備：量取供試品母液1ml置10ml試管中，加1mol/L氫氧化鈉溶液2ml；另取10ml試管加輔料母液1ml，加1mol/L氫氧化鈉溶液2ml；同置沸水浴中加熱5h，放冷，分別加1mol/L鹽酸溶液2ml，分別轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度、搖勻、分別過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.5氧化破壞溶液及氧化空白溶液的制備：量取供試品母液1ml置10ml量瓶中，加30%雙氧水2ml，混勻；另取10ml量瓶加輔料母液1ml，加30%雙氧水2ml，混勻；同置沸水浴中加熱25min，放冷，分別用流動(dòng)相稀釋至刻度、搖勻、分別過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.6光照破壞溶液及光照空白溶液的制備：量取供試品母液1ml置10ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻；另取10ml量瓶加輔料母液1ml，用流動(dòng)相稀釋至刻度；同置強(qiáng)光（8000Lx）下照射破壞15h，搖勻，分別過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.7空白輔料溶液：輔料母液1ml，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相超聲溶解并稀釋置刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為空白輔料液。

精密量取空白輔料溶液及上述各種空白溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖；精密量取各破壞試驗(yàn)溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

結(jié)論：由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，輔料對(duì)本品主成分與雜質(zhì)的檢測(cè)不干擾，色譜圖中瑞伐拉贊主峰保留時(shí)間為13.278min，最先洗脫出的有關(guān)物質(zhì)峰在1.279min時(shí)開(kāi)始檢出，最末洗脫出的有關(guān)物質(zhì)峰在21.741min時(shí)全部檢出，各有關(guān)物質(zhì)峰均能與主成分峰完全分離。與主成分峰相鄰雜質(zhì)和主成分的分離度最小為2.17。結(jié)果表明：在此色譜條件下，各有關(guān)物質(zhì)與主成分可實(shí)現(xiàn)完全分離；故將本品有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)下流動(dòng)相定為：乙腈：甲醇：水：三乙胺（37：37：26：0.05）；檢測(cè)波長(zhǎng)：271nm；柱溫：35℃。

2.2.2定量限及檢測(cè)限試驗(yàn) 精密稱取瑞伐拉贊對(duì)照品49.98mg置25ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得母液。取母液1ml于100ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得溶液Ⅰ；取溶液Ⅰ1ml于50ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度、搖勻，得溶液Ⅱ；取溶液Ⅱ1ml于10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度、搖勻，得溶液Ⅲ。

取溶液Ⅲ20μl分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，此時(shí)主峰響應(yīng)值約為基線噪音的3倍，計(jì)算最小檢出限為0.8ng。

定量限試驗(yàn)：參考最小檢知量和檢出限度試驗(yàn)，取最小檢知量和檢出限度試驗(yàn)之溶液Ⅱ3ml于10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得溶液（未破壞溶液）。

精密量取溶液（未破壞溶液） 20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，此時(shí)主峰響應(yīng)值約為基線噪音的10倍，計(jì)算定量限為2.4ng。

2.3有關(guān)物質(zhì)檢查限度設(shè)計(jì) 以面積歸一化法考察系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中有關(guān)物質(zhì)含量為0.026%，暫設(shè)定本品的有關(guān)物質(zhì)限度為0.5%。

2.4線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱取對(duì)照品49.98mg（約相當(dāng)于C22H23N4F·HCl 49.84mg），置25ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置10ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置100ml容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度、搖勻，即得儲(chǔ)備液；分別精密量取儲(chǔ)備液1、3、5、6、8、10ml，各置10ml量瓶中，分別加流動(dòng)相稀釋至刻度、搖勻；取該系列溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，量取峰面積，以溶液濃度對(duì)峰面積做線性關(guān)系曲線，計(jì)算相關(guān)系數(shù)，評(píng)價(jià)其線性關(guān)系。見(jiàn)表1。

結(jié)果表明：本品在0.1994μg/ml～1.9936μg/ml濃度范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗(yàn) 供試品溶液 取本品，研細(xì)，精密稱取適量（約含瑞伐拉贊10mg），置50ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5ml置10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置100ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度、搖勻，即得。

取上述供試品溶液，置溫度為24℃，光照為實(shí)驗(yàn)室自然光，濕度為RH%34的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，連續(xù)進(jìn)樣6次，20μl/次，記錄色譜圖，量取峰面積，計(jì)算精密度。見(jiàn)表2。

結(jié)果表明：該方法對(duì)本品的測(cè)定精密度符合定量測(cè)定的精度要求。

2.6穩(wěn)定性研究（供試品和對(duì)照）

2.6.1 0.5%對(duì)照溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn) 供試品溶液 取本品，研細(xì)，精密稱取適量（約含瑞伐拉贊10mg），置50ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5ml置10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml置100ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度、搖勻、即得。

取上述供試品溶液，分別在0、2、4、6、8h精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，考察穩(wěn)定性。見(jiàn)表3。

結(jié)果表明：0.5%對(duì)照溶液在8h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.6.2供試品溶液的穩(wěn)定性 供試品溶液 取本品，研細(xì)，精密稱取適量（約含瑞伐拉贊10mg），置50ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解稀釋至刻度、搖勻、濾過(guò)、取續(xù)濾液，即得。

取上述供試品溶液，分別在0、2、4、6、8h，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，量取峰面積，考察穩(wěn)定性。見(jiàn)表4。

結(jié)果表明：供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性符合定量要求。

2.7有關(guān)物質(zhì)檢查 供試品溶液的制備：取本品，研細(xì)，精密稱取適量（約含瑞伐拉贊10mg），置50ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度、搖勻、濾過(guò)、取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照溶液的制備：精密量取供試品溶液1.0ml置100ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取5.0ml置10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度、搖勻、即得。

精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見(jiàn)表5。

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，供試品的有關(guān)物質(zhì)總雜質(zhì)均小于0.1%，單個(gè)雜質(zhì)均小于0.1%。

3 討論

3.1通過(guò)破壞性實(shí)驗(yàn)，表明本法可檢測(cè)破壞后的降解產(chǎn)物峰，且與主成分峰能有效分離，證明本法可行。

3.2本方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確可靠，可作為鹽酸瑞伐拉贊片有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法。

3.3有關(guān)物質(zhì)最小檢測(cè)限測(cè)定表明，本品的最低檢測(cè)限為0.8ng。

參考文獻(xiàn)：

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典2010年版二部附錄[M].中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

編輯/哈濤