舒芬太尼預處理對缺血再灌注時大鼠心肌的保護作用及其對PI3K/Akt的影響

摘要：目的 探討舒芬太尼缺血前預處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用，以及PI3K/Akt信號通路是否在其中起到的作用。方法 成年健康雄性大鼠40只，隨機分成4組（n=10）；S組：掛線，但不結扎前降支，持續(xù)150min；R組：結扎缺血30 min，再灌注120min；Rh組：缺血前5min經(jīng)尾靜脈注射舒芬太尼2μg/kg，后同R組；Rh+PI組：舒芬太尼處理前5min經(jīng)尾靜脈注射PI3K抑制劑20μg/kg，缺血前5min經(jīng)尾靜脈注射舒芬太尼2μg/kg，后同R組；監(jiān)測并記錄心率（HR）、平均動脈壓（MAP）的術前基礎值（T0）、心肌缺血前（T1）、心肌缺血30min后（T2）、再灌注120min后（T3）時的值，再灌注120min后抽血查血清CK-MB、LDH及cTnI值，后取下大鼠心臟，HE染色，免疫組化測定p-Akt、Akt表達量。結果 HR組間同一時間、組內(nèi)不同時間比較均無明顯差異（P>0.05）；R組、Rh組、Rh+I組較S組在T1、T2、T3時的MAP下降顯著（P<0.05）；R組、Rh組、Rh+I組較S組在再灌注120min后的血清CK-MB、LDH、cTnI水平均顯著升高（P<0.05），Rh組的血清CK-MB、LDH、cTnI水平較R組均降低（P<0.05），而Rh+I組與R組的差異則無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；S組的的p-Akt以及p-Akt/Akt明顯低于其他3組（P<0.05），而Akt則無顯著差異（P>0.05）。與R組相比，Rh組的p-Akt表達量較高，p-Akt/Akt值也更高（P<0.05）；與Rh+I組相比，Rh組的p-Akt及p-Akt/Akt值呈現(xiàn)同樣的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 舒芬太尼預處理有助于減輕缺血再灌注對心肌的損傷，并且這種保護作用與PI3K/Akt信號通路的激活相關。

關鍵詞：舒芬太尼；缺血再灌注；心肌保護

心臟這一人體最重要的器官之一在臨床中時常會面對缺血缺氧的打擊，心肺復蘇、心肌梗死后溶栓、心肌梗死后介入以至于冠脈搭橋手術等針對性治療都會涉及缺血再灌注這一病理生理過程帶來的二次損傷[1]。已有的研究證實利用藥物進行缺血預處理可以在一定程度上保護心肌，減輕缺血再灌注帶來的損傷。Schultz及其同事所進行的研究[2]證實缺血前采用阿片類受體激活劑預處理可以有效減少缺血再灌注損傷所致的心肌梗死。另有研究[3]進一步證實嗎啡可以通過激活PI3K/Akt信號通路，拮抗由缺氧這一打擊所誘發(fā)的心肌細胞凋亡。

嗎啡、芬太尼、瑞芬太尼、舒芬太尼等藥物都是臨床上經(jīng)常被使用的阿片類受體激動劑。其中舒芬太尼是一種長效鎮(zhèn)痛藥，通過對μ受體的強效激動作用鎮(zhèn)痛。同時，舒芬太尼對μ1受體具有高選擇性，但對δ受體的親和力很低，具有良好的血流動力學穩(wěn)定性。因此，本試驗旨在探討舒芬太尼缺血前預處理對心肌缺血再灌注損傷的作用，以及PI3K/Akt信號通路是否在其中起到的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 注射用舒芬太尼（宜昌人福藥業(yè)）、兔抗P-Akt（Ser473）抗體（美國Cell Signaling Technology公司）、Akt及p-Akt免疫組化試劑盒（武漢博士德公司）。

1.2動物 成年健康雄性大鼠40只，體重250～320g，由某某實驗動物中心提供（根據(jù)情況改吧）。編號后用計算機將大鼠隨機平均分成4組（n=10）：假手術組（S組）、缺血再灌注組（R組）、舒芬太尼預處理組（Rh組）、舒芬太尼預處理及PI3K抑制劑組（Rh+PI組）。

1.3 動物模型的制備 ①所有大鼠術前12 h禁食不禁水。②稱重，20%的烏拉坦4ml/kg腹腔注射麻醉。將大鼠固定于試驗臺上，四肢連接皮下電極，記錄心電圖和心率（HR）。切開頸部，分別分離出氣管及頸動脈，前者行氣管插管后連接小動物呼吸機行機械通氣（參數(shù)：頻率60～70/min，潮氣量30ml/kg，吸呼比2：1），后者行頸動脈插管，監(jiān)測平均動脈壓（MAP）。③切開胸骨，逐層解剖，充分暴露心臟。在左心耳下1～2 mm處進針于心臟表層下約1.5mm，用6-0無損傷縫線掛線，結扎冠脈前降支使心肌缺血，結扎成功即心肌缺血的標識為：心電圖顯示ST段抬高≥0.1mV、QRS波高度及寬度增大和心肌顏色由鮮紅色變蒼白色再變成暗紅甚至暗黑色。持續(xù)30min后松開結扎線，恢復血流120min。④各組動物處理措施。S組：掛線，但不結扎前降支，持續(xù)150min；R組：結扎缺血30 min，再灌注120min；Rh組：缺血前5min經(jīng)尾靜脈注射舒芬太尼2μg/kg，后同R組；Rh+PI組：舒芬太尼處理前5min經(jīng)尾靜脈注射PI3K抑制劑20μg/kg，缺血前5min經(jīng)尾靜脈注射舒芬太尼2μg/kg，后同R組。抽血后取下大鼠心臟，以冰生理鹽水迅速沖洗干凈后置于4%福爾馬林溶液中固定，24h后石蠟包埋切片，備HE染色及免疫組化使用。

1.4測量指標 ①全程記錄大大鼠心率（HR）、平均動脈壓（MAP）及心電圖變化，記錄術前基礎值（T0）、心肌缺血前（T1）、心肌缺血30min后（T2）、再灌注120min后（T3）的值；②測定再灌注120min后血清CK-MB、LDH及cTnI值：再灌注120min時取腹主動脈血5ml，放置于EP管中，4℃下離心（3000r/min）10min，取上清保存于液氮罐中。ELISA法測定血清CK-MB、LDH及cTnI值；③心肌組織HE染色結果；④測定心肌組織中Akt、p-Akt表達水平：使用Akt及p-Akt兔單克隆抗體（1：100），按試劑盒說明操作，Akt陽性可在鏡下觀察到細胞胞質中的棕黃色顆粒，p-Akt陽性表現(xiàn)為鏡下彌漫分布的棕黃色核膜或胞漿，不染色為陰性。標準灰度校正，在200×下利用Image-Pro Plus 5.0圖像分析軟件（Media Cybemetics公司）分析切片，每張切片隨機選取3個互不重疊的視野，計算平均光密度值（AOI）。

1.5統(tǒng)計學方法 本研究采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計與分析工作。其中，計量資料以x±s 表示。采用單因素AVONA方差分析，多組之間比較采用q檢驗法（SNK法），多組與一個對照組比較時采用最小顯著差數(shù)法（LSD法），組內(nèi)比較采用t檢驗。P<0.05則差異具有統(tǒng)計學意義。

2試驗結果

2.1各組大鼠血流動力學比較 各組大鼠不同時間心率情況如表1所示，組間同一時間比較、組內(nèi)不同時間比較，其差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組大鼠不同時間平均動脈壓情況如表2所示，組內(nèi)不同時間比較，相較于T0時，R組、Rh組、Rh+I組在T1、T2、T3時的MAP下降顯著（P<0.05）；組間比較，在T1、T2、T3三個時點，R組、Rh組、Rh+I組相較于S組MAP下降顯著（P<0.05）。

2.2再灌注120min后血清CK-MB、LDH、cTnI比較 如表3所示，與S組相比，R組、Rh組、Rh+I組在再灌注120min后的血清CK-MB、LDH、cTnI水平均顯著升高（P<0.05）。與R組相比，Rh組的血清CK-MB、LDH、cTnI水平均降低（P<0.05），而Rh+I組的差異則無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表3 再灌注120min后血清CK-MB、LDH、cTnI

表4 各組心肌組織p-Akt及Akt表達情況

2.3各組心肌組織HE染色結果 S組：鏡下心肌肌纖維有序排列，細胞核規(guī)則藍染；R組：鏡下心肌纖維斷裂溶解，血管周圍出現(xiàn)大量炎性滲出，心肌細胞體積明顯增大，其中胞漿伊紅染色陽性，部分細胞出現(xiàn)核破裂；Rh組：鏡下心肌細胞排列基本有序，心肌細胞輕度腫脹；RH+I組：鏡下心肌細胞排列不規(guī)則，可見溶解，心肌細胞體積增大，可見細胞核破裂。

2.4各組心肌組織p-Akt及Akt表達情況 如表4，各組心肌組織均有p-Akt及Akt的免疫組化陽性結果，其中S組的的p-Akt以及p-Akt/Akt明顯低于其他3組（P<0.05），而Akt則無顯著差異（P>0.05）。與R組相比，Rh組的p-Akt表達量較高，p-Akt/Akt值也更高（P<0.05）；與Rh+I組相比，Rh組的p-Akt及p-Akt/Akt值呈現(xiàn)同樣的趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3討論

綜合相關參考文獻[2， 4， 5]，實驗中采用結扎冠狀動脈前降支這一經(jīng)典方法制備心肌缺血模型，采用單次注射舒芬太尼2μg/kg作為預處理，單次注射兔抗P-Akt（Ser473）抗體20μg/kg以拮抗PI3K。根據(jù)上述實驗結果，我們可以看到，與假手術組（S組）相比，心肌在發(fā)生缺血再灌注損傷后表現(xiàn)為MAP下降，血清CK-MB、LDH、cTnI水平上升，即心肌梗死。利用舒芬太尼進行預處理之后（Rh組），雖然HR較假手術組無明顯差異，但血清CK-MB、LDH、cTnI水平顯著降低，表明舒芬太尼預處理確實在發(fā)生缺血再灌注時具有心肌保護作用。與此同時，舒芬太尼預處理后心肌細胞中p-Akt表達量提升，且p-Akt/Akt值也更高；注射PI3K抑制劑后（Rh+I組），p-Akt表達量及p-Akt/Akt值回調，且相應的血清CK-MB、LDH、cTnI水平有上升，可見抑制PI3K之后舒芬太尼的心肌保護作用也被抑制。因而，上述結果可以初步表明舒芬太尼預處理可以通過上調p-Akt的表達保護心肌。

已有的研究表明，通過抑制鈣超載、抑制細胞凋亡、激活再灌注損傷補救酶（RISK）途徑等機制能夠有效減輕缺血再灌注對心肌的損傷。PI3K/Akt信號通路在人體中有著廣泛的作用，參與包括細胞代謝、增殖、遷移等過程在內(nèi)的多種細胞活動并在其中起到關鍵作用[6]。舒芬太尼是阿片類高選擇性μ1受體激動劑，可以刺激Akt的活化使之磷酸化為p-Akt，并引起信號傳導通路的級聯(lián)反應[7]。其中一部分下游分子，包括BAD、GSK-3β、NF-KB等，可以發(fā)揮抗細胞凋亡的作用。既往已有實驗證實傳統(tǒng)的阿片類藥物嗎啡可以激活PI3K/Akt信號通路而使GSK-3β發(fā)生磷酸化，抑制其活性，保護細胞免于凋亡[5]。另一方面，激活的PI3K/Akt信號通路可進一步活化其下游內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）而激活RISK途徑，起到心肌保護作用。

本實驗中，Rh組較S組在HR方面并未出現(xiàn)顯著差異，而MAP則出現(xiàn)了下降。因條件限制，未能直接觀察大鼠左心室功能的變化情況，因而無法探討其中的原因。對舒芬太尼的心肌保護作用的機制也有待于進一步的深入研究。

4結論

通過本實驗的研究，可以基本確定舒芬太尼預處理有助于減輕缺血再灌注對心肌的損傷，并且這種保護作用與PI3K/Akt信號通路的激活相關。

參考文獻：

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編輯/康潔