甜瓜蒂中總葫蘆素的純化工藝研究

摘要：葫蘆素系葫蘆科植物甜瓜（Cucumis melo L.）瓜蒂的提取物。純化工藝方面：通過比較，選擇D101大孔吸附樹脂對(duì)提取物進(jìn)行純化，得到的總葫蘆素中含葫蘆素B（CUB）約30%，確保了葫蘆素提取部位的質(zhì)量。同時(shí)使用大孔樹脂吸附樹脂的方法，減少了有機(jī)溶劑對(duì)藥品的污染。

關(guān)鍵詞：葫蘆素;純化工藝;研究

基金項(xiàng)目：吉林省教育廳課題項(xiàng)目（吉科教合字〔2014〕第452號(hào)）

中圖分類號(hào)： R284.2 " " " " " " " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： "A " " " " " " " " " " "DOI編號(hào)： " 10.14025/j.cnki.jlny.2015.24.038

甜瓜蒂始載于《本經(jīng)》，為葫蘆科植物甜瓜的干燥果柄[1]，含雜醇，皂苷，氨基酸，葫蘆苦素（cu-curbitacin）B、D、E，異葫蘆苦素（isocucurbitacin）B，葫蘆苦素B-2-O-β-D-吡喃葡萄糖甙（cucurbitacin B-2-O-β-D-glucopyranosi-de）等。甜瓜蒂粗提取物中有效成分總葫蘆素（CU）含量較低，雜質(zhì)的存在會(huì)大大降低提取物的藥效，同時(shí)也不利于葫蘆素B單一組分的分離制備。

大孔吸附樹脂是一種不含交換基團(tuán)，具有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。大孔吸附樹脂與凝膠和天然吸附樹脂相比，有表面積大、吸附量大、選擇性好、吸附速度快、易于解吸附、物理化學(xué)穩(wěn)定性高、再生處理簡便、使用周期長、易于構(gòu)成閉路循環(huán)和節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)[2]。近年來，在藥學(xué)領(lǐng)域（尤其天然藥物）中的應(yīng)用普遍受到重視。

本課題是在確定最佳醇提工藝后，使用大孔吸附樹脂對(duì)葫蘆素分離工藝進(jìn)行了系統(tǒng)考察，通過研究大孔吸附樹脂對(duì)葫蘆素的純化工藝，確定了一條較為科學(xué)合理的純化工藝路線。

1 儀器與試藥

1.1儀器

AL204電子天平：梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司;SY-8100型高效液相色譜儀：北京普析通用有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司;薄層色譜用硅膠（批號(hào)：140427）：青島海洋化工有限公司。

1.2 試藥

葫蘆素B對(duì)照品（98%）：成都普菲德生物技術(shù)有限公司;各型號(hào)樹脂：山東魯抗立科藥業(yè)有限公司。

2 上樣樣品制備

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，先后比較了活性炭吸附除雜、甲醇溶解后拌樣工藝，通過比較發(fā)現(xiàn)：前者雖然可以除去葉綠素等大量雜質(zhì)，但同時(shí)也吸附了許多有效成分，損失較大且操作繁瑣;后者經(jīng)甲醇溶解后的液體與樹脂拌樣，很好的滿足了試驗(yàn)的需要，所以最后確定選擇甲醇溶解后拌樣的方式作為上樣液的預(yù)處理方式。

方法：稱取瓜蒂提取物干膏適量，用甲醇溶解，與樹脂拌樣，揮干甲醇，作為上樣樣品，備用。

3大孔吸附樹脂種類的篩選

3.1不同大孔吸附樹脂對(duì)總葫蘆素靜態(tài)飽和吸附量的考察

取已處理好的干樹脂（AB-8，DM130，D301，D101）各約1.0克，精密稱定，置于100毫升錐形瓶中，精密加入甲醇溶解的醇提物5.0毫升（0.5毫克/5毫升），搖勻。間隔20分鐘振搖一次，共進(jìn)行2小時(shí)，然后靜置24小時(shí)，使其充分吸附，平行3份，進(jìn)行含量測(cè)定，測(cè)出吸收度值并計(jì)算飽和吸附量，結(jié)果見表1。

表1 不同大孔樹脂對(duì)CU的靜態(tài)吸附性能比較

表2 不同大孔樹脂對(duì)CU的靜態(tài)解吸性能比較

從表1可以看出，D101樹脂對(duì)CU的吸附率和靜態(tài)吸附量均較高，從靜態(tài)吸附角度來講吸附效果較理想。

3.2 不同大孔樹脂對(duì)葫蘆素的靜態(tài)解吸性能比較

將上述己吸附飽和的大孔吸附樹脂濾出，用濾紙吸干上樣液，置于100毫升錐形瓶中，精密加入70%乙醇20毫升，搖勻，超聲半小時(shí)，然后靜置后，含量測(cè)定，平行3份，測(cè)出吸收度值并計(jì)算靜態(tài)洗脫率，結(jié)果見表2。

總CU的富集和精制是其純化工藝和質(zhì)量控制的關(guān)鍵，CU為非極性化合物，一般需要選用非極性大孔吸附樹脂。本實(shí)驗(yàn)通過比較幾種型號(hào)的大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附性能和靜態(tài)洗脫性能，D101型大孔吸附樹脂無論在飽和吸附量以及洗脫率都表現(xiàn)最佳，所以最后確定D101型大孔吸附樹脂作為純化樹脂。

4 洗脫溶劑的選擇

稱取已處理好的D101型大孔吸附樹脂10.0克，水充分溶漲后，裝入層析柱中，精密吸取上樣液10.0毫升（相當(dāng)于原藥材5.0克），拌樣上樣，以2BV/h的流速過柱，上柱后，依次用蒸餾水、30%乙醇、50%乙醇各400毫升梯度洗脫，70%乙醇1000毫升和95%乙醇400毫升洗脫，每200毫升收集液濃縮至干，分別以甲醇溶解后移入10毫升容量瓶中，以甲醇定容后，采用高效液相色譜法測(cè)出吸收值，計(jì)算各部分洗脫率。確定洗脫溶劑，選取洗脫較集中的洗脫溶劑繼續(xù)下一步試驗(yàn)。以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，洗脫比例為縱坐標(biāo)。結(jié)果見表3。洗脫曲線見圖1。

表3 洗脫溶劑考察結(jié)果

圖1 " 大孔樹脂洗脫曲線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：蒸餾水能夠洗脫糖類等雜質(zhì)，而不會(huì)洗脫葫蘆素類成分，因此，可以初步確定洗脫工藝條件為：先以水30%、50%乙醇洗脫，除去雜質(zhì)，而后以70%乙醇作為洗脫劑，并且確定洗脫劑用量，前三部分均為4倍柱體積，70%乙醇為6倍柱體積，收集70%乙醇洗脫部分。

5 最佳洗脫工藝條件考察

表4 "因素水平表

本研究選擇主要的影響因素樹脂——樣品比例、洗脫流速和徑高比等，分別選擇3個(gè)水平，采用正交實(shí)驗(yàn)L9（34）表進(jìn)行設(shè)計(jì)，以70%乙醇洗脫物的干膏量、總葫蘆素含量以及薄層層析結(jié)果作為考察指標(biāo)。因素水平表見表4，實(shí)驗(yàn)安排和結(jié)果見表5。按照上述實(shí)驗(yàn)安排，測(cè)定結(jié)果，選擇最佳大孔樹脂純化條件。

表5 "正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)安排和結(jié)果

由正交試驗(yàn)分析結(jié)果確定各因素水平不具顯著性，直觀分析結(jié)果可知Bgt;gt;D Cgt;gt;A，洗脫流速影響因素最大，結(jié)合前面所做單因素試驗(yàn)，綜合考慮，最終確定最佳工藝是：樹脂與樣品1∶1比例拌樣，徑高比為1∶10，洗脫流速控制在2BV/h，接收70%乙醇洗脫液濃縮、干燥，得有效部位，備用。

6 純化工藝驗(yàn)證及純度測(cè)定

稱取已處理好的D101型大孔吸附樹脂3份，每份約40.0克，水充分溶漲后，裝入層析柱中，精密吸取上樣液10.0毫升（相當(dāng)于原藥材5.0克），拌樣上樣，先用蒸餾水200毫升 （2BV）、30%乙醇400毫升（4BV）、50%乙醇400毫升（4BV）、70%乙醇600毫升（6BV）依次洗脫，洗脫液流速控制在2BV/h，棄去蒸餾水和30%乙醇、50%乙醇洗脫部分，收集70%乙醇洗脫部分，濃縮干燥至恒重，得干浸膏。取干浸膏10毫克用甲醇溶解，定容至10毫升，精密吸取10ul注入高效液相色譜儀，平行3份，根據(jù)峰面積，計(jì)算所含葫蘆素B含量。結(jié)果見表6。

表6 " D101大孔樹脂純化結(jié)果

從HPLC色譜圖上可以看到上柱前后兩圖譜在峰的個(gè)數(shù)上就有差異，且在信號(hào)強(qiáng)度上，上柱后的葫蘆素B的信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于上柱前的物質(zhì)信號(hào)，說明D101樹脂對(duì)CU有富集作用，起到了純化的效果。

7 結(jié)論

結(jié)合四環(huán)三萜類的性質(zhì)，以甜瓜蒂醇提物為原料，優(yōu)選葫蘆素的吸附純化工藝，同時(shí)使用大孔樹脂吸附樹脂的方法，減少了有機(jī)溶劑對(duì)藥品的污染，能夠得到純度在30%左右的總葫蘆素，確保了葫蘆素提取部位的質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

[1]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典2版[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006.

[2]北京醫(yī)學(xué)院，北京中醫(yī)學(xué)院主編.中草藥成分化學(xué).離子交換層析[附]大孔吸附樹脂.北京：人民衛(wèi)生出版社，1980.34.

作者簡介：趙晶麗，碩士，吉林工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，講師，研究方向：中藥相關(guān)教學(xué)與研究。