半邊旗提取物5F聯合5－Fu對A/J小鼠誘發性肺癌的影響

葉 華，劉 義，吳科鋒，李 立，鄭學寶

(廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東醫學院，廣東 湛江 524023)

肺癌已成為我國惡性腫瘤首要的死亡原因，占全部惡性腫瘤死亡的22.7%，且發病率和死亡率仍在繼續迅速上升，目前我國肺癌發病率每年增長26.9%［1］。大量的流行病學研究證實吸煙與肺癌發生的密切關系，且我國吸煙人口正呈現年輕化、低齡化的趨勢。課題組證實半邊旗提取物5F(11α－羥基－15－氧－16－烯－對映貝殼杉烷－19－酸)對誘發性肺癌特別是由吸煙引起的肺癌具有較好的抑制作用［2］。我們進一步觀察5F與5－氟尿嘧啶(5－Fu)聯合應用對A/J小鼠誘發性肺癌的影響，探討5F與5－Fu聯合用藥的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料 5F干粉由本實驗室(廣東天然藥物研究與開發重點實驗室)提供，經丙二醇溶解，蒸餾水稀釋，制成丙二醇體積分數為0.15%、5F質量濃度為1000 mg·L－1的儲備液，除菌過濾后冷藏保存，實驗時再以培養基稀釋至所需濃度(丙二醇最終濃度≤0.012)。A/J小鼠，6 周齡，體重 18～22 g，香港中文大學惠贈。5－Fu注射液，天津金耀氨基酸有限公司;B［a］P和NNK，購自Sigma公司;丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、尿素氮(BUN)試劑盒、血肌酐(Scr)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 小鼠誘發性肺癌模型的建立 除正常對照組以外，其余各組A/J小鼠均以3 μmol苯并［a］芘(B［a］P)和 3 μmol甲基亞硝胺吡啶基丁酮(NNK)制成的混合誘導劑進行灌胃，每周1次，連續灌胃8周，誘發小鼠肺癌。

1.3 動物分組及給藥 AJ小鼠50只，隨機均分為5 組，正常組、模型組、5F 組(250 mg·kg－1)、5 －Fu組(25 mg·kg－1)和5F+5 －Fu組(5F 50 mg·kg－1+5－Fu 25 mg·kg－1)。從第9周開始，分別腹腔注射相應藥物，模型組給予生理鹽水，連續給藥14周后處死小鼠。眼球眶靜脈采血，取肺、肝、腎等臟器檢測各項指標。

1.4 觀察指標和方法

1.4.1 體重 實驗期間每周稱取小鼠體重。

1.4.2 腫瘤數量 取出肺臟，計算肺臟的腫瘤數量。

1.4.3 臟器系數 取肝臟和腎臟組織，稱重，計算臟器系數，臟器系數 =臟器重量(g)/體重(g)×100。

1.4.4 肝腎功能 按照試劑盒說明書，檢測血清中ALT、AST、BUN 和 Scr的變化。

1.4.5 SOD和MDA檢測 按照試劑盒說明書，檢測血清中SOD和MDA的變化。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件，進行單因素方差分析與析因設計方差分析，兩兩比較用方差齊選用LSD檢驗，方差不齊選用Tamhane's T2檢驗。

2 結果

2.1 5F與5－Fu聯合用藥對NNK和B［a］P誘導A/J小鼠肺癌的影響 如圖1所示，與正常組比較，模型組小鼠體重略有下降，而5F組、5－Fu組和(5F+5－Fu)組小鼠體重略有升高。與模型組比較，5F和5－Fu聯合用藥，或者分別單獨給藥均能降低小鼠腫瘤數量，差異有顯著意義，其中(5F+5－Fu)組腫瘤抑制率最高，達44.36%。5F可以增強5－Fu的治療效果，兩者聯合用藥具有協同效應，結果見表1。

表1 5F和5－Fu聯合應用對NNK和B［a］P誘導A/J小鼠肺癌的影響

圖1 5F與5－Fu聯合用藥對誘發性肺癌小鼠體重的影響

2.2 5F和5－Fu聯合應用對肺癌小鼠肝臟、腎臟系數和肝腎功能的影響 如表2所示，與模型組比較，各給藥組肝臟和腎臟系數沒有明顯變化。血清ALT檢測結果顯示，5F不影響ALT水平，5－Fu組ALT水平升高，但5F與5－Fu聯合應用可降低ALT水平，與5－Fu組比較差異有統計學意義。血清AST檢測結果顯示，模型組AST水平升高，5F組和(5F+5－Fu)組AST水平較模型組降低(P＜0.05或P＜0.01)。血清BUN和Scr檢測結果各組之間沒有顯著差異，結果見表3。

表2 5F和5－Fu聯合應用對肺癌小鼠臟器系數的影響

2.3 5F和5－Fu聯合應用對肺癌小鼠血清SOD和MDA的影響 模型組SOD水平較正常組降低，5F和5－Fu聯合或者分別單獨給藥均能提高SOD水平，與模型組比較有顯著性差異。對血清MDA水平的檢測結果顯示各組無明顯差別，結果見表4。

表3 5F和5－Fu聯合應用對肺癌小鼠血清ALT、AST、BUN 和 Scr的影響

表4 5F和5－Fu聯合應用對肺癌小鼠血清SOD和MDA的影響

3 討論

在世界范圍內，肺癌是所有惡性腫瘤中發病率和死亡率最高的腫瘤［3］。吸煙是肺癌公認的最主要的致病因素，B［a］P和NNK是香煙煙霧所含的主要致癌物質［4，5］。Hecht等［6，7］利用 B［a］P 和 NNK 為誘導劑建立的A/J小鼠肺癌模型，其肺癌形成的機制跟人類有很大相似性，是研究人類肺癌尤其是吸煙引起肺癌的首選模型。因此本研究利用更接近于人體腫瘤生長狀態的A/J小鼠誘發性肺癌模型來探討5F與5－Fu聯合應用在體內的抗腫瘤活性。

5F是從生長在我國南方的傳統中草藥半邊旗中分離得到的一種具有抗腫瘤活性的二萜類化合物［8］。前期的研究證實，在體外5F能抑制 NCIH460、NCI－H23、A549和 CRL－2066等肺癌細胞生長并誘導其凋亡，在體內5F顯著降低NNK誘導的肺癌數量和大小，且對肝腎功能無明顯毒副作用［9，10］。5－Fu 是臨床常用的抗腫瘤藥物，常用于治療肺癌、腸癌、胃癌等多種癌癥，因此，我們將5F與5－Fu合用，探討兩者聯合應用的可行性。

我們的研究結果表明，5F和5－Fu聯合用藥可以顯著降低B［a］P和 NNK誘導的A/J小鼠肺癌數量，腫瘤抑制率達44.36%，與單獨使用5F或5－Fu相比，聯合用藥具有協同效應。對肝臟和腎臟系數，血清ALT、AST、BUN和Scr的檢測顯示，對肝腎功能沒有明顯毒副作用，而且能降低5－Fu導致的ALT和AST升高。此外，5F和5－Fu聯合還顯著提高SOD的水平。這些結果均提示，可以在臨床上將5F與5－Fu聯合應用治療肺癌。然而，目前對于5F與5－Fu協同抗肺癌作用的機制尚不清楚。吸煙所誘發的肺癌會導致K－ras、NF－κB和 p53等基因的改變［11］，在這些分子中，已知5F的抗癌作用與調節NF－κB信號通路和影響p53基因有關，5F與5－Fu的協同效應是否與這些分子有關，有待進一步研究。

［1］支修益.我國肺癌流行病學現狀分析［J］.中國處方藥，2009，83(2):56 －57.

［2］Li MY，Leung J，Kong AY，et al.Anticancer efficacy of 5F in NNK－induced lung cancer development of A/J mice and human lung cancer cells［J］.J Mol Med(Berl)，2010，88(12):1265 －1276.

［3］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):69 －90.

［4］Kishi S，Yokohira M，Yamakawa K，et al.Significance of the progesterone receptor and epidermal growth factor receptor，but not the estrogen receptor，in chemically induced lung carcinogenesis in female A/J mice［J］.Oncol Lett，2014，8(6):2379 －2386.

［5］Shanmugam R，Kusumanchi P，Appaiah H，et al.A water soluble parthenolide analog suppresses in vivo tumor growth of two tobacco－ associated cancers，lung and bladder cancer，by targeting NF － κB and generating reactive Oxygen species［J］.Int J Cancer，2011，128(10):2481 －2494.

［6］Hecht SS，Isaacs S，Trushin N.Lung tumor induction in A/J mice by the tobacco smoke carcinogens 4－(methylnitrosamino)－1－(3－pyridyl)－1－butanone and benzo［a］pyrene:a potentially useful model for evaluation of chemopreventive agents［J］.Carcinogenesis，1994，15(12):2721－2725.

［7］Johnson TE，Hermanson D，Wang Lei，et al.Lung tumorigenesis suppressing effects of a commercial kava extract and its selected compounds in A/J mice［J］.Am J Chin Med，2011，39(4):727 －742.

［8］葉華，龔先玲，李立，等.半邊旗有效成份5F對腹膜炎小鼠血清NO和細胞因子的影響［J］.藥學研究，2014，33(12):683－685.

［9］劉義，Chen George－g，呂應年，等.半邊旗活性物質5F對非小細胞肺癌 NCI－ H460 細胞 Iκ Kβ、IκB、p65 及p50 mRNA 表達的影響［J］.中草藥，2010，41(3):435－439.

［10］Li L，Chen GG，Lu YN，et al.Ent－11α －Hydroxy－15 －oxo－kaur－16－en－19－oic－acid inhibits growth of human lung cancer a549 cells by arresting cell cycle and triggering apoptosis［J］.Chin J Cancer Res，2012，24

(2):109－115.

［11］Tharappel JC，Cholewa J，Espandiari P，et al.Effects of cigarette smoke on the activation of oxidative stress－related transcription factors in female A/J mouse lung［J］.J Toxicol Environ Health A，2010，73(19):1288 －1297.