山楂提取物的質量標準研究

王玉團，時海燕，徐 男，林 曉

(1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101;2.山東省千佛山醫院，山東 濟南 250014;3.國家中醫藥管理局中藥分析重點學科，山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014)

山楂是薔薇科植物，具有藥食兩用的特點。作為中藥，其具有消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂之功效。主要用于肉食積滯、胃脘脹滿、瀉痢腹痛、淤血經閉、產后淤阻、心腹刺痛、胸痹心痛、疝氣疼痛、高脂血等癥。作為食品，其又廣泛應用于食品和保健食品中，既可以增加食品的營養性成分，又可以起到抗氧化的功效，具有廣闊的應用前景。

山楂提取物目前僅有企業標準，標準檢驗項目不夠全面，且缺乏專屬性，故有必要對其質量標準進行研究。山楂提取物主要含有機酸類、黃酮類兩大功效成分，有機酸類物質是消食導滯的主要有效成分，黃酮類物質是防治心血管疾病、降血脂和抗氧化的活性成分，因此選擇有機酸、總黃酮為指標成分進行含量測定。為更好地控制山楂提取物的質量，又對提取物進行了薄層色譜鑒別(TLC)及高效液相特征色譜法(HPLC － FP)研究［1～4］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);Paragon E10xpress箱式電阻爐(美國Paragon公司);DGG－9070B電熱鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司);島津UV－2550紫外分光光度計(日本島津公司);Mettler AE－240型電子分析天平(瑞士梅特勒公司);BK－600C超聲波清洗儀(巴克超聲設備有限公司)。

1.2 試藥及藥品 蘆丁對照品［中國藥品生物制品檢定所，批號:100080－200707，紫外分光光度法(UV)含量為92.5%］;山楂對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號:121138－200905);金絲桃苷(中國藥品生物制品檢定所，批號:111521－201004);牡荊素鼠李糖苷(中國藥品生物制品檢定所，批號:111668－200401);硅膠GF254(青島海洋化工廠分廠，批號:20100808);枸櫞酸(中國藥品生物制品檢定所，批號:100396－200301);所用化學試劑均為分析純。

山楂提取物樣品:山西康立生藥業有限公司3批(鮮山楂提取)、陜西瑞康生物工程有限公司1批(干山楂切片提取)、實驗室自制樣品2批，原料分別是從山西、山東收集到的山楂樣品，經徐麗華主任藥師鑒定為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.的成熟果實。樣品信息見表1。

表1 山楂提取物樣品信息匯總

2 方法與結果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 對照藥材溶液的制備 取山楂對照藥材1.0 g，加水50 mL，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，作為對照藥材溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末1.0 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。

2.1.3 山楂提取物的TLC鑒別 吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷 － 甲醇 － 甲酸(10∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視(見圖1)。供試品色譜中可見與山楂對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點。

2.2 特征圖譜的研究［5，6］經調研，山楂提取物的生產工藝均采用水煎煮法，有機酸類物質是其主要成分，故山楂提取物的特征圖譜應以有機酸類物質為主進行建立。

2.2.1 色譜條件與系統適用性 固定相以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Thermo C18，4.6 mm×250 mm，5 μm);以 0.05 mol·L－1磷酸二氫銨(pH 2.5)為流動相;流速為1.0 mL·min－1;檢測波長為210 nm，柱溫:30℃。理論板數按枸櫞酸峰計算應不低于6000。進樣量10 μL。

圖1 山楂提取物的薄層鑒別圖譜(溫度:25℃;濕度:55%)

2.2.2 參照品溶液的制備 取枸櫞酸對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品0.1 g，精密稱定，精密加入水25 mL，超聲使溶解，濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 精密度 取同一供試品溶液連續進樣5次，以枸櫞酸峰為參照峰，比較各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果各共有色譜峰的相對保留時間與相對峰面積的RSD均小于0.96%，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.2.5 穩定性 取同一供試品溶液，分別于 0、1、2、4、12 h進樣，進行測定，比較各共有峰與參照物峰的相對保留時間和相對峰面積，結果表明各共有指紋相對保留時間和相對峰面積的RSD小于0.92%，符合指紋圖譜的檢測要求，表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

2.2.6 重復性 取山西康立生藥業有限公司樣品0.1 g(1號樣品)，精密稱定，共6份，按“2.2.3”項下方法制得供試品溶液，進行測定。結果各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于0.25%，符合指紋圖譜的檢測要求。

2.2.7 樣品測定 取樣品1～6號各0.1 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制得供試品溶液，按上述方法進行測定，測得結果見圖2和表2。

圖2 樣品HPLC－FP圖譜

表2 樣品特征圖譜相對保留時間值

根據上述結果，理論板數按S峰(枸櫞酸峰)計算應不低于6000，供試品特征圖譜應呈現5個特征峰，各色譜峰與S峰的相對保留時間分別為:0.53(峰 1)、0.60(峰2)、0.69(峰 3)、0.76(峰 4)、1.00(峰S)，應在規定值的±5%范圍內。

2.3 有機酸的含量測定［7］采用以酚酞為指示劑，酸堿滴定法測定有機酸的含量。

2.3.1 對照品儲備液的制備 取枸櫞酸對照品適量，加水制成每1 mL含0.8704 mg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品0.5 g，精密稱定，精密加入水100 mL，超聲使溶解，搖勻，過濾，即得。

2.3.3 測定方法 精密量取供試品溶液50 mL，加水150 mL，加酚酞指示液5滴，用氫氧化鈉滴定液(0.1 mol·L－1)滴定，即得。每1 mL氫氧化鈉滴定液(0.1 mol·L－1)相當于 6.404 mg的枸櫞酸(C6H8O7)。

2.3.4 重復性試驗 取本品0.5 g，共6份，精密稱定，精密加入水100 mL，超聲使溶解，搖勻，過濾，即得。照“2.3.3”項下方法測定，計算含量，結果RSD為0.62%。

2.3.5 穩定性試驗 取本品0.5 g，按照“2.3.2”制得供試品溶液，分別在 0.5、1、2、3、5 h即得。照“2.3.3”項下方法測定，計算含量，結果 RSD為0.62%。

2.3.6 加樣回收試驗 取山楂提取物(山西1，批號:01，水分為5.5%，有機酸含量為18.30%)的樣品約0.25 g，精密稱定，平行6份，分別精密加入對照品儲備液50 mL，精密加入水50 mL，超聲使溶解，搖勻，濾過，即得供試品溶液。照“2.3.2”項下的方法測定，計算加樣回收率，結果見表3。

2.3.7 含量測定 依據“2.3.3”項下測定方法進行，結果見表4。

根據上述6批樣品測定結果，暫定本品按干燥品計算，含有機酸以枸櫞酸(C6H8O7)計，不得少于15.0%。

2.4 總黃酮含量(UV 法測定)［8～11］

表4 有機酸含量測定結果(n=3)

2.4.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得(每1 mL中含蘆丁0.2 mg)。

2.4.2 供試品溶液的制備 取本品0.25 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，超聲處理30 min，放冷至室溫，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，即得。

2.4.3 測定方法 精密量取供試品溶液6 mL，置25 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加50%甲醇至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑為空白，照紫外－可見分光光度法，在500 nm的波長處測定吸光度。

2.4.4 線性關系考察 精密稱取蘆丁對照品13.88 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取 1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加50%甲醇至6 mL，照“2.4.3”項下方法，測定吸光度，以吸光度為縱坐標(Y)，對照品溶液濃度為橫坐標(X)，繪制標準曲線。結果蘆丁在濃度為0.01027～0.06163 mg·mL－1范圍內，線性關系良好，回歸方程為:Y=12.221X+0.01(r=0.9997)。

2.4.5 重復性試驗 取山楂提取物(山西1，批號:01)樣品0.25 g，精密稱重，共6份，分別置50 mL量瓶中，照“2.4.3”項下方法測定，計算含量，RSD為1.27%。

2.4.6 加樣回收試驗 取山楂提取物(山西1，批號:01，水分為5.5%，總黃酮含量為11.80%)的樣品約0.12 g，精密稱定，平行6份，分別精密加入對照品儲備液25 mL(蘆丁濃度為0.5380 mg·mL－1)，精密加入50%甲醇25 mL，超聲處理，放冷至室溫，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。照“2.6.3”項下的方法測定，計算加樣回收率，結果見表5。

表5 加樣回收試驗結果

2.4.7 樣品的測定 精密稱取本品0.25 g，照“2.4.2”項方法制備供試品溶液，照“2.4.3”項下方法測定，計算含量，結果表6。

表6 含量測定結果

根據上述6批樣品測定結果，暫定本品按干燥品計算，含總黃酮以蘆丁(C27H30O16)計，不得少于8.0%。

3 討論

3.1 因該提取物生產的季節性很強，且儲藏條件要求較高，故各生產企業很少留樣，導致收集的批次受限，為保證所建立的特征圖譜的科學性，仍需進一步收集樣品，繼續該項研究。

3.2 在特征圖譜的研究過程中，曾嘗試用甲醇－0.1%磷酸(5∶95)、0.05 mol·L－1磷酸二氫銨、0.05 mol·L－1磷酸二氫銨(pH=2.5)等多種流動相進行試驗，結果甲醇－0.3%磷酸(5∶95)為流動相色譜峰保留時間較小，不利于色譜峰的分離比較;用0.05 mol·L－1磷酸二氫銨為流動相，枸櫞酸色譜峰有拖尾現象;用0.05 mol·L－1磷酸二氫銨(pH=2.5)為流動相分離效果較好，保留時間較合適，且流動相為緩沖鹽，便于控制流動相的pH范圍，有利于提高有機酸類物質色譜分離的重現性。

3.3 試驗中曾采用HPLC法測定山楂提取物中金絲桃苷和牡荊素鼠李糖苷含量［12］，結果金絲桃苷含量在0～0.13%范圍內，牡荊素鼠李糖苷含量在0.03%～0.10%范圍內，各批次間差異非常明顯，且含量較低，故暫不列入標準正文。

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