HPLC法測定桑椹配方顆粒中槲皮素的含量

任菲菲，鄭艷青，馬 斐，張 靜，李智慧

(德州市食品藥品檢驗檢測中心，山東 德州 253020)

桑椹配方顆粒是以符合炮制的桑椹飲片為原料，經現代工藝提取、濃縮、干燥、精制而成的顆粒［1］，具有生津止渴、補肝益腎、滋陰補血、烏須黑發、聰耳明目、延緩衰老、安神養心、潤腸通便等功效［2］。與傳統桑椹飲片相比桑椹配方顆粒即保持了傳統飲片的所有特征，又優于傳統煎煮，藥效成分更加穩定。便于服用、攜帶，在臨床用藥中可隨證組方［3］。近年來，配方顆粒在國內外受到了廣泛追捧，但目前的標準都相對滯后，有必要對其質量標準進行研究。

本文采用高效液相色譜法(HPLC)對桑椹配方顆粒中的槲皮素進行了測定［4，5］，該法簡便、快速、重現性好，可以有效地對桑椹配方顆粒的質量進行控制，并為桑椹配方顆粒標準的提升提供了依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Model 9960D超聲波清洗機;ML204電子分析天平;Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司);在線真空脫氣機(G－1332A);高壓四元泵(G－1311A);紫外檢測器;Agilent 1200 Series色譜工作站;標準自動進樣器(G－1329A);色譜柱恒溫箱(G－1316A);可變波長檢測器(G－1314B)。

1.2 試劑 槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:100081－200907);甲醇為色譜純(山東禹王實業有限公司化工分公司);水為超純水，其余試劑為分析純;桑椹配方顆粒(三九藥業，1.5 g相當于原藥材10 g;新綠色藥業科技發展股份有限公司，1.4 g相當于原藥材10 g;江陰天陰藥業，3 g相當于原藥材10 g;湖南春江九匯股份有限公司，1.8 g相當于原藥材10 g)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱Krcomasil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm);甲醇 －0.4%磷酸溶液(43∶57)［6］為流動相;流速為1.0 mL·min－1;檢測波長為360 nm［7］;進樣量 20 μL;柱溫 40 ℃。理論板數按槲皮素峰計應不低于4000;槲皮素其他雜質峰的分離度R大于1.5。

2.2 對照品溶液制備 取槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含171.2 μg的標準儲備液。

2.3 供試品溶液的制備 取供試品適量，研細，取約1.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇超聲處理 30 min［8］，過濾，濾液加入 1.5 moL·L－1鹽酸溶液20 mL［9］，加熱回流 1 h，放冷，濾過，轉移至 50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，試液過0.45 μm膜，即得［10］。

2.4 線性關系考察 精密吸取171.2 μg·mL－1的標準儲備液1 mL置100 mL容量瓶中，配置成濃度為1.712 μg·mL－1的槲皮素對照品溶液，在上述色譜條件下分別進樣 2、4、6、8、10 μL，按上述色譜條件，測定峰面積(色譜圖見圖1)。以對照品進樣量為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，得槲皮素回歸方程為Y=3078.3X－0.32，r=0.9997(n=6)。結果表明，槲皮素在0.003424～0.01712 μg線性關系良好。

圖1 槲皮素HPLC色譜圖

2.5 精密度試驗 分別精密吸取“2.4”項下的對照品溶液10 μL，按上述色譜條件，連續進樣5次，以峰面積計算，RSD為0.8%，表明精確度良好。

2.6 重復性試驗 取三九醫藥所產的同一批(批號:141000W)桑椹配方顆粒6份，分別按“2.3”項下方法制備供試品，按上述色譜條件測定，槲皮素的平均含量為 25.27 μg·g－1，RSD 為 2.0%，表明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 精密吸取“2.6”項下的同一供試品溶液 20 μL，隔 0、1、2、3、4、5 h 進樣 6 次，以峰面積計算，RSD為0.8%，表明供試品溶液在5 h內保持穩定。

2.8 回收率試驗 取已知含量的樣品(三九醫藥，批號:141000W，25.27 μg·g－1)，研細，取約 0.6 g，精密稱定，共取6份，分別精密加入10 mL槲皮素對照品(濃度為1.712 μg·mL－1)，按“2.3”項下方法制備，于上述色譜條件測定，計算回收率，結果見表1，表明本方法具有良好的回收率。

表1 加樣回收率實驗結果(n=6)

2.9 樣品測定 取不同廠家的桑椹配方顆粒，按“2.3”項下方法制備成供試品溶液，按上述色譜條件測定，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果

3 小結與討論

對流動相進行了考察，因加入適量的酸可以抑制槲皮素色譜峰的拖尾現象［11］，故選用甲醇－磷酸體系。分別對甲醇－0.2%磷酸溶液，甲醇－0.4%磷酸溶液流動相體系進行比較，結果表明甲醇－0.4%磷酸溶液分離效果較好。考察甲醇－0.4%磷酸溶液不同的比例，結合峰型，分離度等因素，最終確定流動相的比例為 43∶57。對 25、30、35、40 ℃ 等不同柱溫進行考察，結果表明40℃時槲皮素和其他雜質峰能很好地分離且出峰快，最終確定柱溫為40℃。

對回流時間進行了考察，樣品超聲過濾后分別加熱回流 15 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h，按上述色譜條件檢測，結果表明1 h時桑椹配方顆粒中的槲皮素已水解提取較完全，隨加熱回流時間的延長，槲皮素反而有所損失，故確定回流時間為1 h。

隨著時代的發展，中藥配方顆粒越來越受到了大家的重視，在部分醫院已作為處方藥使用，但關于配方顆粒質量標準的研究報道較少，建議加強對其質量標準的更新，尤其是多指標質量控制標準的研究［12］。

［1］陳平.中藥配方顆粒對豐富、發展傳統中藥湯劑的作用與意義［J］.中華中醫藥雜志，2005，20(5):314－315.

［2］謝晶，翟曉華，趙麗珺，等.桑椹功效及產品開發［J］.食品研究與開發，2004，25(2):85 －88.

［3］毛翼，李霞，翁德會，等.免煎中藥配方顆粒與傳統中藥湯劑的比較［J］.湖北中醫雜志，2007，29(11):62.

［4］張媛，李立，王曉楊，等.HPLC法同時測定桑葚口服液中槲皮素和山奈酚的含量［J］.江西中醫學院學報，2013，25(1):46 －48.

［5］張超.HPLC法測定市售蒺藜飲片中3種黃酮苷元的含量［J］.藥學研究，2014，33(3):139 －141.

［6］陳海霞，劉向紅，梁宏臣.HPLC法測定煙臺柴胡中蘆丁和槲皮素的含量［J］.安徽農業科學，2013，41(8):3382 －3383，3479.

［7］黃佳萍，鄭青，郭夢夢，等.超聲波法提取烏飯樹葉槲皮素的工藝研究［J］.安徽農業科學，2013，41(9):4050－4052.

［8］郭培果.高效液相色譜法測定通淋舒片中槲皮素的含量［J］.中國民族民間醫藥，2013，22(13):13 －14.

［9］中華人民共和國衛生部.保健食品檢驗與評價技術規范(2003年版)［S］.北京:中華人民共和國衛生部，2013:289.

［10］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:204.

［11］衛星星，王轉花.高效液相色譜法測定苦蕎籽殼中蘆丁和槲皮素的含量［J］.藥物分析雜志，2007，27(12):1909－1910.

［12］賈曉斌，陳彥，蔡寶昌，等.HPLC法測定川芎配方顆粒中阿魏酸的含量［J］.南京中醫藥大學學報，2004，20(1):60－61.