甘川散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

葉錦雄，詹利之，李睿鈞，梁志鋒

(1.廣州市東升醫(yī)院，廣東 廣州 510140;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心，廣東 廣州 510405)

甘川散在廣州市東升醫(yī)院使用已有一百多年歷史，由大黃、關(guān)黃柏、黃芩、赤芍、冰片組成。具有清熱解毒、消腫止痛的功效。用于治療癰瘡紅腫灼痛、帶狀皰疹等病癥，療效確切，且毒副作用小［1］。該制劑標(biāo)準(zhǔn)目前僅制定大黃及關(guān)黃柏的顯微鑒別。為了能更好地控制其質(zhì)量，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行再研究，對(duì)處方中大黃、黃芩、關(guān)黃柏采用顯微特征進(jìn)行鑒別，對(duì)赤芍、冰片采用薄層色譜法(TLC)進(jìn)行鑒別，對(duì)君藥大黃采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)大黃素進(jìn)行含量測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀(LC－20A，SPD－20A紫外檢測(cè)器);島津電子天平(AUW120D);TLC Silica gel 60(Merck KGaA);Apple 4s(TLC拍照)。

1.2 試藥 甘川散(批號(hào):粵藥制字Z20070666，我院制劑室生產(chǎn));赤芍對(duì)照品(批號(hào):121093－200402，中國(guó)藥品生物制品檢定所);冰片對(duì)照品(批號(hào):110743－200905，中國(guó)藥品生物制品檢定所);大黃素對(duì)照品(批號(hào):110756－200110，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所);乙腈、冰醋酸均為色譜純、水為超純水;乙醇、甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲酸、石油醚(30～60℃)等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒定 取甘川散少許，放在載玻片上滴加1滴水合氯醛溶液，攪拌，在酒精燈上加熱。透化3次，加1滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，然后放在顯微鏡下顯微觀察［2］:草酸鈣簇晶棱角短鈍 (大黃)。晶纖維常成束，鮮黃色(關(guān)黃柏)。韌皮纖維棱形，淡黃色，壁厚(黃芩)［3］。顯微鑒別圖見(jiàn)圖1。

2.2 薄層鑒別

圖1 顯微鑒別圖

2.2.1 赤芍薄層鑒別［3］取甘川散2 g，加乙醇10 mL，振搖5 min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取赤芍對(duì)照藥材0.25 g，加乙醇10 mL，同上法制成對(duì)照藥材溶液。取不含赤芍按甘川散工藝生產(chǎn)的陰性對(duì)照2 g，按供試液方法制成陰性對(duì)照溶液。參考薄層色譜鑒別方法［3］，吸取上述3 種溶液各 2 μL，分別于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯 － 乙醇 － 水(5∶1∶1，V/V/V)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)，空白對(duì)照液在相應(yīng)的位置上無(wú)斑點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 赤芍薄層鑒別圖

2.2.2 冰片薄層鑒別 取甘川散1 g，加乙酸乙酯5 mL，振搖10 min，濾過(guò)，濾液在室溫下自然濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取冰片對(duì)照藥材0.5 mg，加乙酸乙酯1 mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。取不含冰片按甘川散工藝生產(chǎn)的陰性對(duì)照1 g，按供試品溶液的方法制備陰性對(duì)照溶液。參考薄層色譜鑒別方法［3］，吸取上述 3種溶液各 4 μL，分別于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)－乙酸乙酯(9∶1，V/V)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯橙紅色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照在相對(duì)應(yīng)的位置上無(wú)斑點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3 含量測(cè)定

圖3 冰片薄層鑒別圖

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 －水 －冰醋酸(60∶40∶1，V/V/V);檢測(cè)波長(zhǎng):437 nm;流速:1.0 mL·min－1;柱溫:30℃。理論板數(shù)按大黃素計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取大黃素對(duì)照品約10 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品約1 g，精密加入三氯甲烷25 mL和2.5 mol·L－1硫酸溶液20 mL，稱定重量，置80℃水浴中，回流30 min，冷卻至室溫，過(guò)濾，再稱定重量，用三氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，置分液漏斗中分取三氯甲烷層，精密量取10 mL，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓D(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3.4 取不含大黃的全部處方藥材，按甘川散工藝生產(chǎn)及上述供試品溶液方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各 10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，結(jié)果表明大黃素與其他成分色譜峰能較好分離，陰性對(duì)照對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 供試品HPLC色譜圖 1.大黃素

2.3.6 線性關(guān)系考察 精密量取大黃素對(duì)照品(8.128 μg·mL－1)各 0.5、1、2、3、4、5 mL，分別置 5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含大黃素 0.8128、1.6256、3.2512、4.8768、6.50244、8.128 μg 的對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液各 10 μL，注入液相色譜儀，按照“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。大黃素的回歸方程為:Y=1.43 ×106X －1.05 ×106(r=0.9995，n=6)。結(jié)果表明大黃素在 0.8128～8.128 μg·mL－1之間呈良好的線性關(guān)系。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 精密進(jìn)樣同一對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)測(cè)定6次，大黃素平均峰面積的 RSD為0.51%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品供試液適量，照“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，于供試液配制后 0、2、6、12、18、24 h，按照“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定其含量，大黃素的峰面積RSD為1.21%，結(jié)果表明被測(cè)溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為141001樣品6份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法分別測(cè)定，6份樣品中大黃素的平均含量 0.4742 mg·g－1，RSD 為 1.24%，結(jié)果表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 稱取批號(hào)為141001樣品0.5 g，共9份，分別精密稱定，3份為1組，每組按樣品含量的80%、100%、120%加入大黃素對(duì)照品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試液，依“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定大黃素含量并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(n=9)

2.3.11 樣品含量測(cè)定 取樣品 3批(批號(hào)為140301、140501、141001)，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行HPLC含量測(cè)定，含量測(cè)定的結(jié)果表明，3批樣品大黃素的含量分別 0.4721、0.4738、0.4786 mg·g－1。

3 討論

3.1 處方中大黃、關(guān)黃柏、黃芩的組織細(xì)胞特征在顯微鏡下容易觀察，與其它藥材組織無(wú)交叉干擾，方法簡(jiǎn)便快捷。對(duì)赤芍采用藥典的薄層鑒別方法［3］，陰性對(duì)照有干擾，且展開(kāi)劑含三氯甲烷，根據(jù)有關(guān)法律法規(guī)，三氯甲烷受公安部門(mén)所管制，毒性較大，且對(duì)環(huán)境有危害，可造成水體污染，故沒(méi)對(duì)此展開(kāi)劑系統(tǒng)進(jìn)行深入研究，因此采用安全低毒的試劑對(duì)赤芍薄層色譜鑒別進(jìn)行試驗(yàn)。采用展開(kāi)劑為乙酸乙酯－乙醇(5∶1，V/V)能順利進(jìn)行薄層鑒別，但斑點(diǎn)偏大。改用展開(kāi)劑為乙酸乙酯－乙醇－水(5∶1∶1，V/V/V)后，無(wú)拖尾現(xiàn)象，陰性對(duì)照無(wú)干擾，分離效果較好。冰片薄層鑒別參考其他多種方法［3～6］，均無(wú)法較好地展開(kāi)，但經(jīng)用乙酸乙酯提取后再用本展開(kāi)劑展開(kāi)，斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾。以上薄層色譜鑒別所用試劑均安全低毒，值得推廣。

3.2 據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［7～9］，大黃素 HPLC 含量測(cè)定有多種流動(dòng)相選擇，最終參考文獻(xiàn)［10］，在該條件下，對(duì)方中大黃素的分離效果好，基線較平穩(wěn)，重復(fù)性好，達(dá)到了較好含量測(cè)定目的，可用于大黃素的含量測(cè)定。由于時(shí)間和精力的限制，未對(duì)其他大黃素類(lèi)成分進(jìn)行含量測(cè)定研究。

以上測(cè)定方法重復(fù)性好、簡(jiǎn)便，可用于控制甘川散的質(zhì)量。

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