金絲桃素納米制劑的設計與發展

田 佳，李亞楠，沈 雁

(1.河北亞東醫藥進出口有限公司，河北 石家莊 050061;2.中國藥科大學藥學院藥劑學教研室，江蘇 南京 210009)

1 金絲桃素性質及其應用研究

金絲桃素是二蒽酮類物質，英文名為hypericin(縮寫為Hy)，其系統命名為4，4，5，5，7，7 － 六羥基 －2，2 － 二甲基 －中位－萘并二蒽酮，結構如圖1，金絲桃素對光、熱非常敏感，常溫存放幾天就會被氧化。金絲桃素是金絲桃屬植物貫葉連翹提取物的主要活性成分之一，呈棕黑色流動性粉末，或為藍黑色針狀結晶，有特殊清香，味苦，不溶于水;易溶于吡啶和其他有機堿，成櫻紅色溶液，并顯紅色熒光;可溶于堿的水溶液，幾乎不溶于其他有機溶劑。可由大黃素進行合成［1，2］。一直以來，金絲桃素多被用于治療皮膚創傷、病毒感染和抗抑郁等方面［3］，但近幾年來，金絲桃素在抗腫瘤靶向與治療、光學診斷中的研究頗多。研究發現，金絲桃素不僅是一種天然的光敏劑，經光激活可產生單線態氧，可以用來治療多種癌癥，最新發現可用于治療如膀胱癌、前列腺癌、垂體瘤、卵巢癌等;此外，該化合物具有很強的壞死組織親和性且易于進行放射性碘標記，山東省醫學科學院制備了碘－131金絲桃素標記物并進行詳盡的研究結果表明，碘標記的金絲桃素在靶區的藥物濃度，是對應組織的十倍甚至幾十倍，且在重要臟器無明顯蓄積，由此說明金絲桃素是一種理想的靶向藥［4］。由于金絲桃素對腫瘤部位又是一種造影劑，可以用來診斷癌癥的位置、大小以及評估癌癥的嚴重程度［5］，使其便于后期的診斷和治療，金絲桃素對膀胱腫瘤部位的熒光診斷特異性和敏感性高達95%和94%，遠高于其他的5－氨基酮戊酸等光敏劑［6］，并且在診斷和外科手術切除中不會產生光漂白作用;腫瘤與正常組織之間界限不明顯，尤其浸潤性的腫瘤可視化非常難，不易區分，使得外科手術難以徹底切除腫瘤。而金絲桃素可以使腫瘤熒光視化，在熒光顯微鏡下能夠將實體瘤、正常組織及二者之間的過渡區域清晰地區分開來，避免了漏切游離癌細胞和殘留癌細胞，增加了早期癌癥的治療率。因此，近幾年，金絲桃素作為一種有高效治療作用的光敏劑和靶向藥成為研究熱點。

圖1 金絲桃素的結構

金絲桃素本身的光敏治療效果很好，再加上其理想的腫瘤壞死親和性，成為腫瘤研究中的關注熱點。光動力學藥物本身相比于化療藥物具有無法比擬的優點:首先，在無光照的條件下，本身幾乎無毒性，可減少非靶向組織的毒性，副作用小，而且光動力學中的光照屬于非離子化光，對無光敏劑的組織無副作用［7］。但是由于金絲桃素較高的親脂性導致水溶性較小，并且針對腫瘤的治療單獨的金絲桃素溶液給藥靶向性差，從而在臨床上的使用受限。因此，近幾年改善金絲桃素的水溶性，提高其生物利用度是開展金絲桃素研究的新方向。一些文獻報道加入增溶劑和潛溶劑以增加金絲桃素的溶解性。一直以來，乙醇或者其他的有機試劑用來作為金絲桃素的潛溶劑［8］，還可以利用牛血清蛋白增溶，臨床上用的熒光診斷滴注劑是使用1%的血漿蛋白溶液［9］，但有研究表明血清白蛋白會降低金絲桃素細胞的攝取，因為金絲桃素與人體血清白蛋白結合過于緊密，導致難以釋放進入細胞發揮作用，雖提高了水溶性，卻降低了療效，在臨床上不提倡使用［10］。

納米制劑的優勢在于可以將藥物最大程度的運送至治療部位發揮作用，提高金絲桃素的水溶性，增加其在血漿中的半衰期，減緩藥物的降解從而使副作用降低，提高藥物的生物利用度。此外，納米制劑材料毒性低，生物相容性和安全性高，能夠提高藥物在體內的安全性。通過納米劑型比如膠束，脂質體，納米粒，以及大分子衍生物等增加金絲桃素的穩定性和靶向性從而減少全身組織的光毒性等副作用，極大的改善了金絲桃素的不足。目前關于金絲桃素的納米制劑的研究很多，但是這方面的綜述卻很少見。為了更好的指導關于金絲桃素在制劑方向上的發展，本文就金絲桃素納米制劑質量的影響因素及包裹金絲桃素的不同納米載體的研究作出詳述。

2 影響金絲桃素納米制劑的重要因素

金絲桃素的納米制劑研究發現，如下參數影響著納米載體的包封率和腫瘤靶向性，見表1。

半衰期:包裹金絲桃素的納米粒的半衰期主要決定于腎清除率和網狀內皮系統(RES)的清除，納米粒粒徑大于15 nm的腎過濾閾值可減少腎清除率［11］，將納米粒外面修飾親水性的聚乙二醇(PEG)或者其他親水性的支鏈可以減少血漿蛋白和巨噬細胞的吸附從而避免RES系統的清除，因此可以增加金絲桃素的半衰期，導致更多的金絲桃素在腫瘤部位蓄積［12］。除了腫瘤部位的血管組織滯留與滲透效應(EPR)，也可以在納米粒周圍修飾主動靶向的配體、抗體、葉酸、透明質酸等與腫瘤部位高度表達的受體相結合，從而增加納米粒對腫瘤部位的靶向性［13］。

表1 納米制劑的影響因素

包封率:光動力學藥物和化藥在包封率這個參數上有很大的不同，一般化療藥物包封率越高，毒副作用越大。但金絲桃素納米制劑在高載藥量的情況下可能會產生金絲桃素在在載體內部的聚集，在光激發的同時會自我猝滅單線態氧從而使治療作用降低［14］，因此其最適合的載藥量并一定是最高的載藥量，同時要盡可能將金絲桃素包載于納米載體內核中，防止藥物物理或者化學吸附在在體表面在血漿中的不穩定性。因此金絲桃素的納米制劑應該保證其載藥量能在不聚集，不自我失效的情況下達到治療的有效性，同時在體循環的過程中藥物分子不泄漏至血漿中。

藥物的釋放:化療藥的納米制劑需要從載體中釋放出來進入細胞才能發揮藥效，與此不同的是，金絲桃素等光動力學藥物發揮作用的本質其實是單線態氧，真正的金絲桃素從納米制劑中的釋放其實是不必要的，因為氧可以自由擴散進入納米載體，與光激發的金絲桃素發生反應轉變成單線態氧，然后再從載體中出來在細胞中發揮毒性作用［15］。因此，金絲桃素的納米制劑需要牢固地將其包裹于內部盡量減少漏藥，從而運送至腫瘤部位從而進行接下來的光動力治療。

3 金絲桃素納米制劑的研究現狀

3.1 金絲桃素大分子衍生物 金絲桃素主要以被動擴散進入細胞，主要通過水溶性通道，因此很多研究制備了金絲桃素水溶性衍生物，首先，有研究制備了金絲桃素－脂蛋白大分子衍生物，但細胞攝取結果表明這種衍生物會降低金絲桃素細胞的攝取，因為金絲桃素與蛋白結合過于緊密，導致難以釋放進入細胞發揮作用，雖提高了水溶性，卻降低了療效。金絲桃素－聚乙烯吡咯烷酮(PVP)衍生物［16］，相比于單獨的金絲桃素，此衍生物在相關的神經元細胞和膠質細胞中發現具有更高的攝取和毒性。之后，有研究發現金絲桃素－環糊精衍生物能夠快速的和細胞膜結合并進入Caco－2細胞，可能是因為金絲桃素－環糊精的親脂基團能通過疏水作用力有效的結合細胞表面的脂質雙分子層膜，增加金絲桃素的攝取［17］。金絲桃素的水溶性衍生物不僅增加了金絲桃素的水溶性，而且還能增加金絲桃素的入胞量從而增加藥效，但是，研究發現金絲桃素－水溶性衍生物本身的穩定性相比于游離金絲桃素未有明顯改善，容易被RES系統識別清除，而且對腫瘤無明顯的靶向性，只適合局部注射。

3.2 脂質體 兩性分子如磷脂分散于水相時，分子的疏水尾部傾向于聚集在一起，而親水頭部暴露在水相，形成具有雙分子層結構的封閉囊泡，既可以包載疏水性藥物，也可以包載親水性藥物，稱為脂質體。脂質體除了磷脂之外，一般還需要膽固醇提高流動性，而且脂質體可以利用其和細胞膜融合的特點，將藥物遞送至細胞內部。脂質體作為一種簡單的納米制劑，可以克服金絲桃素的疏水性和水溶性低的缺點，相比于其他的納米制劑較為簡單［18］。目前，有很多其他的光動力學藥物的脂質體正在處于臨床考察，比如四－(間羥基苯基)二氫卟酚(mTHPC)的二棕櫚酰磷酯酰膽堿(DPPC)/二棕櫚酰磷酯酰甘油(DPPG)－脂質體(Foslip.)［19］等。傳統的脂質體主要包含磷脂和膽固醇，但是容易被RES系統樹識別并清除，之后便發展了一種功能化的磷脂，比如PEG化磷脂可以減少與血漿蛋白發生凝聚，從而增加在體內的長循環，化療的長循環脂質體已經上市［20］。然而，由于脂質體本身的穩定性較差使其在脂質體的水溶液中也容易凝聚，無法有效的被細胞攝取從而影響光動力治療的效果。有研究發現金絲桃素的脂質體在人體結腸癌Caco－2細胞中的攝取與在正常腸上皮細胞中的攝取相同，并無明顯的靶向作用。基于此，有研究者開發了一種新型的包載金絲桃素介孔硅納米粒，在其周圍修飾上脂質分子層可以有效提高靶向性以及金絲桃素的生物相容性，此納米粒可以實現在人體乳腺癌MCF－7細胞中更高的攝取［21］。

3.3 聚合物膠束 金絲桃素的靶向給藥載體中，聚合物膠束具有以下的優勢:疏水性內核的載藥量高;而親水性表面比如PEG等可實現體內的長循環作用，防止被體內的巨噬細胞和RES系統攝取，間接的提高在腫瘤部位的藥量;膠束10～100 nm的粒徑可利用腫瘤微環境的血管組織EPR效應在腫瘤部位蓄積，減少副作用;但是膠束的形成必須要求大于聚合物材料的臨界膠束濃度(CMC)，因此CMC越低越好，從而能在體內循環中保持較好的穩定性，近幾年已經發展了腫瘤微環境刺激相應的光動力學聚合物膠束，比如溫敏型膠束。Cristianne研究了金絲桃素熱敏性的mPEG－b－p(HPMAm－Lac2)［聚乙二醇－聚(N－(2－羥丙基)甲基丙烯酰胺－二乳酸］膠束，粒徑60 nm能實現較好的被動靶向性，腫瘤微環境中，乳酸側鏈的斷裂使臨界膠束溫度增大，膠束裂解從而在腫瘤部位釋藥［22］。

3.4 納米粒 納米載體材料首先要具有生物相容性，近幾年可降解性材料形成納米粒研究越來越多，其中最為廣泛的便是以聚乳酸(PLA)、聚乳酸－羥基乙酸共聚物(PLGA)或者多聚各氨酸(PGA)為骨架通過溶劑揮發法制備的納米粒，同時也可通過PLGA的PEG化形成長循環的核殼納米粒，可減少在生物體內的聚集。相比于游離金絲桃素，Zeisser－Labouebe發現，其制備的載金絲桃素的PLA－PLGA納米粒在治療卵巢癌的過程中能夠在較低劑量的藥物濃度下實現100%的光動力學的誘導細胞死亡，提高藥物的生物利用度［23］。除此之外，在治療宮頸癌和前列腺癌中，金絲桃素包裹的二氧化硅納米粒、富勒烯納米籠，環糊精納米粒等均能有效的產生單線態氧殺死腫瘤細胞［24］。

固體脂質納米粒(SLN)結合了聚合物納米粒，脂肪微乳和脂質體的優點，能有效保護包裹藥物抵抗化學清除和光降解。SLN的結構包括生物相容性的脂質內核和表面活性劑構成的外殼，有效降低了納米制劑的毒性，因此成為光動力學藥物的理想載體［25］。Lima等［26］通過超聲法制備了金絲桃素的SLN載體，最大的優勢是其具有大于80%的包封率和5.22%的載藥量，并未發生凝聚現象;相比于游離藥物，Hy－SLN有高于30%的轉染率，對腫瘤細胞的光毒性也有26%的提高，表明SLN包裹金絲桃素能有效的產生大量的單線態氧殺死腫瘤細胞，生物利用度高。

4 金絲桃素納米制劑研究所面臨的問題及發展方向

首先，納米制劑在金絲桃素主要是以胞吞的形式進入細胞，能增加金絲桃素在腫瘤部位的蓄積，但是，金絲桃素發揮作用的話需要進入腫瘤內部，除了穿透上皮細胞之外還需要更深的穿透進入腫瘤。因此，在未來的發展中可以將促滲透劑和納米制劑相結合，使金絲桃素更好地發揮診斷和治療作用;此外，金絲桃素發揮作用需要將氧激發變成單線態氧從而產生毒性，而主要殺滅的是富氧和高代謝的腫瘤細胞，而腫瘤細胞的乏氧細胞的增殖是當前癌癥治療的一大瓶頸，即使納米制劑包裹也只是提高了藥物的靶向性和在有氧細胞中的毒性，因此需要將金絲桃素的光動力學作用與改善腫瘤區域的乏氧條件的治療方法相結合，來發掘和改造金絲桃素納米制劑潛在的價值和應用。

［1］Ebermann R，Alth G，Kreitner M，et al.Natural products derived from plants as potential drugs for the photodynamic destruction of tumor cells［J］.J Photochem Photobiol B，1996，36(2):95 －97.

［2］Falk H.From the photosensitizer hypericin to the photoreceptor stentorin－the chemistry of phenanthroperylene quinones［J］.Angew Chem Int Ed Engl，1999，38(21):3116－3136.

［3］Kasper S，Caraci F，Forti B，et al.Efficacy and tolerability of Hypericum extract for the treatment of mild to moderate depression［J］.Eur Neuropsychopharmacol，2010，20(11):747－765.

［4］孟斌，馬婭，朱偉，等.金絲桃素的碘－131標記［J］.中國輻射衛生，2013，22(5):610 －613.

［5］Jocham D，Stepp H，Waidelich R.Photodynamic diagnosis in urology:state － of－ the － art［J］.Eur Urol，2008，53(6):1138－1148.

［6］D＇Hallewin MA，De Witte PA，Waelkens E，et al.Fluorescence detection of flat bladder carcinoma in situ after intravesical instillation of hypericin［J］.J Urol，2000，164(2):349－351.

［7］Miller JD，Baron ED，Scull H，et al.Photodynamic therapy with the phthalocyanine photosensitizer Pc 4:the case experience with preclinical mechanistic and early clinicaltranslational studies［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2007，224(3):290－299.

［8］Chung PS，Saxton RE，Paiva MB，et al.Hypericin uptake in rabbits and nude mice transplanted with human squamous cell carcinomas:study of a new sensitizer for laser phototherapy［J］.Laryngoscope，1994，104(12):1471 －1476.

［9］Jichlinski P.New diagnostic strategies in the detection and staging of bladder cancer［J］.Curr Opin Urol，2003，13(5):351－355.

［10］Lavie G，Mazur Y，Lavie D，et al.The chemical and biological properties of hypericin—a compound with a broadspectrum of biological－ activities［J］.Med Res Rev，1995，15(2):111－119.

［11］Jain RK，StylianopoulosT.Stylianopoulos，Delivering nanomedicine to solid tumors［J］.Nat Rev Clin Oncol，2010，7(11):653－664.

［12］Moghimi SM，Hunter AC，Murray JC.Long－ circulating and target－ specific nanoparticles:theory to practice［J］.Pharmacol Rev，2001，53(2):283 －318.

［13］Sharman WM，van Lier JE，Allen CM.Targeted photodynamic therapy via receptor mediated delivery systems［J］.Adv Drug Deliv Rev，2004，56(1):53 －76.

［14］Master AM，Livingston M，Oleinick NL，et al.Optimization of a nanomedicine－based silicon phthalocyanine 4 photodynamic therapy(Pc4－PDT)strategy for targeted treatment of EGFR － overexpressing cancers［J］.Mol Pharm，2012，9(8):2331 －2338.

［15］Sumer B，Gao J.Theranostic nanomedicine for cancer［J］.Nanomedicine(Lond)，2008，3(2):137 －140.

［16］Kubin A，Meissner P，Wierrani F，et al.Fluorescence diagnosis of bladder cancer with new water soluble hypericin bound to polyvinylpyrrolidone:PVP － hypericin［J］.Photochem Photobiol，2008，84(6):1560 －1563.

［17］Sattler S，Schaefer U，Schneider W，et al.Binding，uptake，and transport of hypericin by Caco － 2 cell monolayers［J］.J Pharm Sci，1997，86(10):1120 －1126.

［18］Kozlowska D，Foran P，MacMahon P，et al.Molecular and magnetic resonance imaging:The value of immunoliposomes［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61(15):1402－1411.

［19］Buchholz J，Kaser－ Hotz B，Khan T，et al.Optimizing photodynamic therapy:in vivo pharmacokinetics of liposomal meta－(tetrahydroxyphenyl)chlorin in feline squamous cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2005，11(20):7538－7544.

［20］Torchilin VP.Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers［J］.Nat Rev Drug Discov，2005，4(2):145－160.

［21］Yang Y，Song W，Wang A，et al.Lipid coated mesoporous silica nanoparticles as photosensitive drug carriers［J］.Phys Chem Chem Phys，2010，12(17):4418 －4422.

［22］Rijcken CJ，Hofman JW，van Zeeland F，et al.Photosensitiser－loaded biodegradable polymeric micelles:preparation，characterisation and in vitro PDT efficacy［J］.J Control Release，2007，124(3):144 －153.

［23］Park YI，Kim HM，Kim JH，et al.Theranostic probe based on lanthanide－doped nanoparticles for simultaneous in vivo dual－ modal imaging and photodynamic therapy［J］.Adv Mater，2012，24(42):5755 －5761.

［24］Zhou L，Wei S，Ge X，et al.External heavy － atomic construction of photosensitizer nanoparticles for enhanced in vitro photodynamic therapy of cancer［J］.J Phys Chem B，2012，116(42):12744 －12749.

［25］Mitri K，Shegokar R，Gohla S，et al.Lipid nanocarriers for dermal delivery of lutein:preparation，characterization，stability and performance［J］.Int J Pharm，2011，414(1 －2):267－275.

［26］Lima AM，Pizzol CD，Monteiro FB，et al.Hypericin encapsulated in solid lipid nanoparticles:phototoxicity and photodynamic efficiency［J］.J Photochem Photobiol B，2013，125:146－154.