三峽庫(kù)區(qū)丹參中砷暴露對(duì)小鼠的肝腎毒性損傷研究*

劉 佳 ，黃海兵 ，余 蕾

（1.重慶三峽中心醫(yī)院，重慶 404120； 2.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 404120）

丹參 Salvia miltiorriza Bunge.為常用的活血化瘀藥，藥用其根及根莖，性味苦、微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等功效［1］。但由于受生長(zhǎng)環(huán)境及地域等影響，易致丹參藥材中重金屬有害元素，如砷（As）、鎘（Cd）、鉛（Pb）、汞（Hg）等含量超標(biāo)［2-3］。前期研究發(fā)現(xiàn)，三峽庫(kù)區(qū)丹參中砷含量超標(biāo)。砷是全球重要的環(huán)境污染物之一，可致機(jī)體多器官損傷甚至癌癥［4-5］。楊瑞瑛等［6］用亞砷酸鈉誘導(dǎo)出大鼠亞急性砷中毒模型，顯示中毒組大鼠各臟器組織中砷的含量均極顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。本試驗(yàn)中選用三峽庫(kù)區(qū)產(chǎn)丹參，用丹參提取物給小鼠灌胃給藥，觀察砷的代謝靶器官肝、腎病理學(xué)變化，并測(cè)定砷敏感毒性基因的表達(dá)，為丹參中砷元素的質(zhì)量控制和毒理學(xué)研究提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試藥與儀器

動(dòng)物：昆明種小鼠，清潔級(jí)，雄性，體重18～22 g，合格證號(hào)0002438，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)環(huán)境SPF級(jí)，室溫20～25℃，相對(duì)濕度40% ～70%，每日光照12 h，每籠5只，自由攝食、飲水。

試藥：丹參采集于重慶萬(wàn)州區(qū)后山鎮(zhèn)，經(jīng)重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系李晶博士鑒定為正品。雄黃（北京同仁堂有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z11020959）；RNA提取純化試劑盒（南京建成生物研究所，貨號(hào)為E058）；逆轉(zhuǎn)試劑盒、Trizol（寶生物工程＜大連＞有限公司，貨號(hào)分別為 DRR014A，9109）；SYBR Green PCR Master Mix（英國(guó) ABI公司，貨號(hào)為 4367659）；金屬硫蛋白 -1（MT-1）引物（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，上游序列AATGTGCCCAGGGCTGTGT，下游序列 GCTGGGTTGGTCCGATACTATT）；其他試劑均為分析純。

儀器：Olympus 7060型全自動(dòng)血生化分析儀（日本）；AFS-2100型全自動(dòng)雙道原子熒光光譜儀（北京科創(chuàng)海光儀器有限公司）；PTC-225 型 real time RT-PCR 儀（BIO-RAD，美國(guó)）；TU-180型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Labstar 96孔多功能梯度 PCR儀 （德國(guó)）；電子天平（200S，Sanyo Company，日本）；Millipore SAS 67120 型超純水儀（Millipore Inc，美國(guó)）。

1.2 方法

動(dòng)物分組與給藥：取小鼠35只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，丹參低、中、高劑量組（20，40，80 mg ／kg）和雄黃組（80 mg ／kg）。丹參提取物系經(jīng)水提、大孔吸附樹脂純化所得，純化后丹參提取物以丹參總酚酸為標(biāo)準(zhǔn)（含量79.3%），每1 g含生藥15.46 g。正常對(duì)照組未做任何處理，其他4組連續(xù)灌胃給藥7 d，每天1次。

血清肝腎功能指標(biāo)測(cè)定：第8天斷頭處死小鼠后取血，以全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）的含量。

組織中砷含量檢測(cè)：各取肝、腎組織約50 mg，分別放入消化罐中，加酸，烤箱175℃消化3.0 h，自然冷卻后轉(zhuǎn)入試管，超純水定容，混勻，即得樣品消化液。取消化液樣品5 mL，加入1 mL 5%硫脲-抗壞血酸溶液混合，靜置5 min后，以原子熒光光譜儀測(cè)定樣品中砷含量。

病理學(xué)觀察：取適量肝臟中葉和腎組織（含皮、髓質(zhì)），4%甲醛固定、石蠟包埋、切片，HE染色，觀察各組肝臟和腎組織病理學(xué)變化。

MT-1 mRNA表達(dá)檢測(cè)：取各組小鼠肝、腎組織各50 mg，加入Trizol 1 mL，勻漿（冰上操作），萃取沉淀，RNA柱純化。以紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度。按RNA抽提試劑盒操作提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，以此為模板低溫下加樣PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括 cDNA 3 μL，引物 0.5 mL，SYBR Buffer溶液8 μL，去RNA酶水4 μL和內(nèi)參。加入96孔板后PCR儀檢測(cè)肝、腎組織中MT-1 mRNA的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清肝腎功能指標(biāo)

結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn)，與正常對(duì)照組比較，血清中ALT，AST，BUN和Cr水平雄黃組均顯著升高（P＜0.05），而丹參各劑量組雖有所變化，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表?1 5組小鼠肝腎功能指標(biāo)變化比較（ ± s，n＝7）

表?1 5組小鼠肝腎功能指標(biāo)變化比較（ ± s，n＝7）

注：與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

組別正常對(duì)照組丹參低劑量組丹參中劑量組丹參高劑量組雄黃組ALT（U ／L）51.2 ± 1.67 52.2 ± 1.54 52.6 ± 1.72 53.1 ± 2.07 64.3 ± 1.86*AST（U ／L）254 ± 3.12 257 ± 1.74 260 ± 1.85 263 ± 2.49 283 ± 2.45*BUN（mmol／L）12.2 ± 1.32 13.0 ± 1.56 12.9 ± 1.94 13.2 ± 1.69 16.9 ± 2.16*Cr（μmol／L）10.2 ± 2.56 10.6 ± 2.19 11.1 ± 1.87 11.4 ± 1.75 15.6 ± 2.55*

2.2 肝、腎組織病理學(xué)變化

病理解剖：5組大鼠肝臟、腎臟解剖無(wú)大體病變。肝軟色紅，邊緣清晰，表面無(wú)出血、黃色等顯著病理變化。腎被膜完整，腎實(shí)質(zhì)表面光滑，無(wú)出血、淤血等明顯病變。

大鼠肝臟HE染色組織學(xué)病變觀察：正常對(duì)照組肝小葉間隔整齊，呈多面棱柱狀，結(jié)構(gòu)完整，以中央靜脈為中心肝細(xì)胞向四周呈放射狀排列，無(wú)變形和炎性浸潤(rùn)或纖維組織增生；雄黃組肝細(xì)胞體積增大，鏡下見(jiàn)部分肝細(xì)胞明顯水腫；與正常對(duì)照組比較，丹參各劑量組均無(wú)明顯變化（見(jiàn)圖1 A）。

腎臟HE染色組織學(xué)病變觀察：正常對(duì)照組和丹參各劑量組均無(wú)明顯改變，而雄黃組腎小管上皮細(xì)胞明顯水腫，間質(zhì)出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)，腎小球膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞在管腔內(nèi)形成細(xì)胞管型，血管無(wú)明顯擴(kuò)張（見(jiàn)圖1 B）。

2.3 肝、腎組織MT-1 mRNA表達(dá)

正常對(duì)照組及丹參各劑量組MT-1 mRNA表達(dá)量無(wú)明顯變化，而雄黃組表達(dá)量顯著升高。

2.4 肝、腎組織砷蓄積量檢測(cè)

結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，僅丹參高劑量組小鼠肝臟中檢測(cè)到微量砷，而腎臟未檢出。雄黃組肝、腎組織均檢測(cè)到砷蓄積。

3 討論

丹參因其毒副作用小、療效好而深受青睞，但由于在栽培、加工、貯存等過(guò)程中，不同程度地受到有毒有害物質(zhì)的污染而影響了其安全性［6-7］。中藥中重金屬含量超標(biāo)是一個(gè)非常突出的問(wèn)題［8-9］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，常用的300多種中藥材中，很多生藥所含As，Pb，Hg，Cd等重金屬大大超過(guò)了美國(guó)食品藥物管理局（FDA）規(guī)定的指標(biāo)，有的則是農(nóng)藥殘留超標(biāo)或含F(xiàn)DA認(rèn)定的毒性成分［10-11］。三峽庫(kù)區(qū)所產(chǎn)丹參主要為砷含量超標(biāo)，其余重金屬如鎘、汞等含量均未超標(biāo)。

圖1 大鼠肝、腎組織病理學(xué)變化（×200）

表2 各組肝、腎組織砷蓄積檢測(cè)結(jié)果（ ± s，n ＝7，ng／g）

表2 各組肝、腎組織砷蓄積檢測(cè)結(jié)果（ ± s，n ＝7，ng／g）

注：ND表示未檢測(cè)到。

組別正常對(duì)照組丹參低劑量組丹參中劑量組丹參高劑量組雄黃組肝臟砷含量ND ND ND 0.09 ± 0.02 136.58 ± 4.88腎臟砷含量ND ND ND ND 80.95 ± 3.61

肝臟是砷毒性作用的主要靶器官，近年來(lái)動(dòng)物試驗(yàn)和人群流行病學(xué)調(diào)查均表明砷可引起不同程度的肝損害，ALT和AST是反映肝細(xì)胞炎性損傷的重要指標(biāo)［8］。腎臟是砷及其代謝物排泄的主要器官，也是砷主要的蓄積部位和毒性靶器官之一。BUN和Cr主要通過(guò)腎臟排泄，為評(píng)價(jià)腎功能的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中的丹參用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中成藥中丹參含量，連續(xù)灌胃給藥1周后小鼠血清中ALT、AST、BUN和Cr水平與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明丹參大量給藥對(duì)小鼠肝、腎功能幾乎無(wú)影響。

砷的毒理作用機(jī)制可能和激發(fā)活性氧自由基導(dǎo)致的氧化性損傷有關(guān)。MT-1存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)多器官的細(xì)胞質(zhì)，可與砷結(jié)合為配合物，解除其毒性，保護(hù)肝、腎等臟器。與正常對(duì)照組比較，丹參各劑量給藥組小鼠腎組織中均未檢測(cè)到砷，也未見(jiàn)MT-1 mRNA表達(dá)量顯著升高。

砷的毒理學(xué)研究證明，肝、腎損傷程度和砷蓄積量呈正相關(guān)。雄黃組小鼠的體內(nèi)肝、腎組織檢測(cè)到一定量的砷蓄積，僅丹參高劑量組肝臟檢測(cè)出微量砷，而低、中劑量組肝組織及丹參各劑量組腎臟中均未檢測(cè)到砷蓄積。

綜上所述，丹參中所含坤的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于雄黃的毒性，常規(guī)劑量給藥是安全的。

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