梔子中有效成分對A549細胞XOD活性及其mRNA表達的影響研究※

● 朱繼孝 李雪溦 曾金祥 羅光明 朱玉野 王曉云

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梔子中有效成分對A549細胞XOD活性及其mRNA表達的影響研究※

● 朱繼孝*李雪溦 曾金祥 羅光明 朱玉野 王曉云

目的：研究梔子中有效成分對A549細胞黃嘌呤氧化酶(XOD)活性及其mRNA表達的影響。方法：選擇梔子中5個化合物(梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II、山梔苷甲酯和去乙酰車前草酸甲酯)，研究其對A549細胞體內XOD活性的抑制作用，并采用RT-PCR檢測別嘌呤醇、梔子苷和西紅花苷-I對XOD mRNA表達的影響。結果：梔子苷、西紅花苷-I和山梔苷甲酯50、100μmol·L-1處理組細胞XOD活性與空白對照組有極顯著差異(P<0.01)，其中梔子苷和西紅花苷-I對XOD抑制作用較強，西紅花苷-II和去乙酰車前草酸甲酯 對A549細胞XOD活性的抑制較弱，與空白對照組無顯著差異(P>0.05)。別嘌呤醇、梔子苷和西紅花苷-I各劑量處理組的XOD mRNA水平與空白對照組相比均沒有顯著差異(P>0.05)。結論：梔子苷和西紅花苷-I對XOD活性抑制作用可能是梔子降尿酸作用機制之一。

梔子 痛風 黃嘌呤氧化酶

痛風是一種嘌呤代射紊亂所致的疾病，其臨床表現主要是反復發作的關節炎、痛風性腎病、痛風凝結物沉積、尿酸性泌尿系統凝結物生成，關節紅、腫、熱、痛反復發作，尤以第一跖趾關節最為常見，關節周圍有痛風石單鈉尿酸鹽(monosodium urate，MSU)沉積[1]。血尿酸升高是痛風的重要生化基礎[2]。近年來，痛風的發病率呈上升趨勢，其發病機制及藥物治療和新藥研發已越來越引起人們的重視。XOD是體內催化黃嘌呤、次黃嘌呤氧化生成尿酸的酶。本課題組前期研究表明梔子提取物及不同部位能顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平，抑制XOD活性是其降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的機制之一[3-4]。本研究選擇梔子中的5個化合物，研究其對人肺癌細胞A549 XOD活性的影響，進一步研究梔子降尿酸可能作用機制。

1 材料

1.1 儀器 UV2100紫外可見分光光度儀(北京瑞利分析儀器公司)；電熱恒溫水溫箱(上海博迅實業有限公司)；高速冷凍離心機(美國 Beckman-Coulter公司)；YXQ-LS-50A全自動高壓滅菌器(上海博迅實業有限公司)；二氧化碳培養箱(美國Thermo Scientfic公司)；MJ-PTC200 PCR儀(美國Bio-Rad公司)；DYY-III-5穩壓穩流電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2 試劑 梔子苷(批號：110749-201214)購自中國藥品生物制品檢定所；西紅花苷-I(批號：1275-120709)、西紅花苷-ΙΙ(批號：1276-120709)、山梔苷甲酯(批號：1335-130411)、去乙酰車前草酸甲酯(批號：1338-130411)均購自江西中醫藥大學中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心；新生牛血清(杭州四季青公司)；DMEM干粉、Penicilin-Streptomycin、胰酶(Gibco公司)；Trizol Reagent (美國Invitrogen公司)；M-mLV反轉錄酶(美國Promega公司)；其它試劑均為國產分析純。人肺癌細胞A549由江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室惠贈。XOD引物：上游： 5’-TCGTCCAGGGTCTTGGTCTC-3’，下游：5’- GGCGTTACTGTCTCCGTGCT-3’，擴增片段長度為275bp；GAPDH內參引物：上游：5’-TGAGGCCGGTGCTGAGTATGT-3’，下游：5’-CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’，擴增片段長度為299 bp；均由上海生工生物技術服務有限公司合成。

2 方法

2.1 細胞培養 人肺癌細胞A549培養于含10%的胎牛血清DMEM培養液中，該培養液含100IU·mL-1的青霉素和卡那霉素，于37℃下5%CO2孵箱內培養，每2～3天稀釋傳代培養。實驗時取處于對數生長期的細胞，接種于24孔培養板，加入1mL DMEM培養液。

2.2 梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II、山梔苷甲酯和去乙酰車前草酸甲酯對A549細胞體內XOD活性的影響

2.2.1 分組與給藥 實驗分為14組，每組6孔，包括對照組和實驗組。對照組為空白對照組和DMSO對照組，空白對照組單純用含10%新生牛血清的DMEM培養液繼續培養，DMSO對照組加入終濃度為1%的DMSO，實驗組別嘌呤醇、梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II、山梔苷甲酯、去乙酰車前草酸甲酯用DMSO溶解，處理終濃度分別為50μmol·L-1和100μmol·L-1。

2.2.2 細胞內XOD的提取 細胞經藥物處理后，再置于CO2孵箱內培養3h，取出，傾去培養液，用pbs緩沖液(pH7.5，200mM)洗滌1次，加入少量胰酶消化2～3min，加入1mL培養液終止消化，吸出細胞懸液置于離心管中，1000rpm·min-1離心5min(4℃)，棄去上清液，沉淀加入0.5mL pbs緩沖液(pH7.5，200mM)，超聲15min破碎細胞，12000rpm·min-1離心10min(4℃)，取上清液，用于XOD活性測定。

2.2.3 XOD活性的測定 取細胞離心上清液0.35mL，加到pH8.0磷酸鉀鹽緩沖液200mM(含有1mM的EDTA-Na)中，置于37℃水浴中，再加入底物黃嘌呤溶液(終濃度為100μM)開始反應，反應30min后加入0.25mL HCl(0.58M)終止反應。空白對照液中不加入細胞離心上清液，預先加入0.25mL HCl(0.58M)終止反應。在290nm處測定吸收度。細胞離心上清液總蛋白質的測定用Lowry法測定，以小牛血清蛋白做標準蛋白。

2.3 RT-PCR檢測別嘌呤醇、梔子苷和西紅花苷-I對XOD 基因表達的影響

2.3.1 分組與給藥 實驗分為24組，每組4孔，包括對照組和實驗組。其中8組經藥物處理12h后檢測XOD mRNA含量，對照組為空白對照組和DMSO對照組，實驗組別嘌呤醇、梔子苷、西紅花苷-I根據抑制曲線分別選擇對XOD活性抑制50%和70%的處理終濃度，其中別嘌呤醇處理終濃度分別為11μmol·L-1和26μmol·L-1，梔子苷處理終濃度分別為45μmol·L-1和200μmol·L-1，西紅花苷-I處理終濃度分別為41μmol·L-1和200μmol·L-1；另外8組經藥物處理24h后檢測XOD mRNA含量，實驗分組同12h處理；最后8組經藥物處理48h后檢測XOD mRNA含量，實驗分組同12h給藥處理。

3 結果

3.1 梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II、山梔苷甲酯和去乙酰車前草酸甲酯對A549細胞體內XOD活性的影響 藥物處理3h，DMSO對照組與空白對照組無顯著差異，別嘌呤醇50、100μmol·L-1處理組A549細胞XOD活性與空白對照組有極顯著差異(P<0.01)，對A549細胞XOD活性的抑制率分別為72.25%和74.34%，梔子苷、西紅花苷-I和山梔苷甲酯50、100μmol·L-1處理組細胞XOD活性與空白對照組也有極顯著差異(P<0.01)，其中梔子苷和西紅花苷-I對XOD抑制作用較強，西紅花苷-II和去乙酰車前草酸甲酯對A549細胞XOD活性的抑制較弱，僅有西紅花苷-II 100μmol·L-1處理組的細胞XOD活性與空白對照組有顯著差異(P<0.05)。除去乙酰車前草酸甲酯組，各化合物高劑量組對細胞XOD活性的抑制率均大于該化合物低劑量組(P<0.05)。梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II、山梔苷甲酯、去乙酰車前草酸甲酯對細胞XOD活性的抑制均弱于相同劑量的別嘌呤醇。見表1。

表1 梔子苷、西紅花苷-I、西紅花苷-II、山梔苷甲酯、去乙酰車前草酸甲酯和別嘌呤醇處理

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與低劑量組比較，▲P<0.05。

3.2 RT-PCR檢測別嘌呤醇、桅子苷和西紅花苷-1對XOD基因表達的影響 藥物處理12h、24h、48h，瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR擴增條帶清晰，DMSO對照組與空白對照組XOD mRNA水平接近，別嘌呤醇、梔子苷和西紅花苷-I各劑量處理組的XOD表達與空白對照組相比均沒有顯著差異。見圖1。

圖1 RT-PCR檢測A549細胞中XOD基因轉錄產物結果

4 討論

隨著人們生活水平的不斷提高、飲食結構的改變，痛風患病率逐年升高，人們對痛風的發病和治療也越來越重視。西藥治療痛風起效快，療效好，藥物作用的機理研究較為深入，對于痛風的急性治療和慢性治療均有相應的有效藥物，但西藥治療痛風不良反應較大，秋水仙堿有效劑量和中毒劑量相近，具有腎毒性[5]，非甾體類抗炎藥具有胃腸道毒性[6]，腎上腺皮質激素與促腎上腺皮質激素停藥后往往出現“反跳”現象[7]，促尿酸排泄藥會引起尿酸鹽晶體在尿路的沉積，引發腎絞痛和腎功能損害[8]，而目前臨床應用廣泛的抑制尿酸生成藥別嘌呤醇雖然價格便宜，抑制XOD效果好，但副作用也多，包括過敏性皮疹、史蒂文斯-約翰遜綜合癥、腎毒性[9-10]等。西藥的不良反應限制了其在痛風治療過程中的使用。中醫藥治療痛風毒性小，許多學者作了臨床研究，取得了一定的治療效果。中草藥來源的XOD抑制劑，毒性低且來源廣泛，在有效阻止和延緩痛風、高尿酸血癥等疾病方面顯示了良好的應用前景。

從多種細胞株中可以富集得到XOD，如人肺癌細胞A549[11]、人慢性髓性白血病細胞系K562[12]等，有報道測定了人肺癌細胞A549中的嘌呤代謝過程多個酶的活性，包括黃嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脫氨酶(ADA)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)、腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(APRT)、鳥嘌呤酶(Guanase)，XOD抑制劑只抑制A549細胞中的XOD活性，而對其它酶沒有抑制作用[13]。因此，本實驗選擇人肺癌細胞A549，開展梔子有效成分的體外實驗，測定其對A549細胞XOD活性及其mRNA表達的影響。

本實驗在小鼠體內實驗的基礎上，選擇梔子中所含有的5個化合物，研究其對人肺癌細胞A549 XOD活性的影響。研究發現梔子苷和西紅花苷-I對于細胞XOD活性的抑制效果強于山梔苷甲酯、西紅花苷-II、去乙酰車前草酸甲酯。梔子苷和西紅花苷-I呈現一定的量效關系，與體內實驗的結果基本相符，進一步佐證梔子苷和西紅花苷-I對XOD活性抑制作用可能是其降尿酸作用機制之一。細胞經梔子苷和西紅花苷-I處理后，RT-PCR結果顯示XOD mRNA表達沒有顯著變化，表明梔子苷和西紅花苷-I抑制XOD活性與XOD mRNA表達可能沒有直接關系，有待進一步研究。

[1]Okamoto K. Inhibitors of xanthine oxidoreductase[J]. Japanese Journal of Clinical Medicine，2008，66(4)：748-753.

[2]徐 嬌，易立濤，翁連進，等. 月腺大戟乙醇提取物的抗痛風活性研究[J]. 中藥材，2014，37(2)：320-323.

[3]朱繼孝，朱玉野，羅光明，等. 梔子提取物降低小鼠急性高尿酸血癥血尿酸水平及機理研究[J]. 安徽農業科學，2011，39(36)：22317-22318.

[4]朱繼孝，曾金祥，羅光明，等. 梔子降尿酸有效部位研究[J]. 中國實驗方劑學雜志，2012，18(14)：140-143.

[5]陳雪梅，柳 軍，宋金萍，等. 秋水仙堿對大鼠腎細胞NRK體外毒性機制初步探討[J]. 中國臨床藥理學與治療學，2011，16(5)：496-500.

[6]Hochberg，MC. COX-2 selective inhibitors in the treatment of arthritis：a rheumatologist perspective[J]. Curr Top Med Chem，2005，5(5)：443-448.

[7]常 明，楚文南，謝惠民. 腎上腺皮質激素的合理應用[J]. 中國醫刊，2008，43(7)：7-12.

[8]劉二剛. 抗痛風性關節炎中藥的研究[D]. 浙江大學，2012.

[9]楊 媛，李 靜，甄健存，等. 抗痛風藥別嘌呤醇、苯溴馬隆及秋水仙堿不良反應報告分析[J]. 中國醫院藥學雜志，2013，33(15)：1297-1298.

[10]Okamoto K.Inhibitors of xanthine oxidoreductase[J]. Japanese Journal of Clinical Medicine. 2008，66(4)：748-753.

[11]Papi A1，Contoli M，Gasparini P. Role of xanthine oxidase activation and reduced glutathione depletion in rhinovirus induction of inflammation in respiratory epithelial cells[J]. J Biol Chem. 2008，283(42)：28595-606.

[12]Abdelwahed A，Bouhlel I，Skandrani I，et al. Study of antimutagenic and antioxidant activities of Gallic acid and 1，2，3，4，6-pentagalloylglucose from Pistacia lentiscus Confirmation by microarray expression profiling[J]. Chem Biol Interact，2007，165(1)：1-13.

[13]Tetsuya Y，Moriwaki Y J，Yoshihiro F，et al. Effect of TEL-6720，a xanthine oxidase inhibitor，on the nucleoside transport in the lung cancer cell line A549[J]. Pharmacology，2000，60：34-40.

江西省衛生廳中醫藥科研計劃(No.2012A163)

朱繼孝，男，副教授，理學博士。主要從事中藥成分與作用機理研究工作。E-mail: zhujx81@sina.com

江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心(330004)