山茱萸果核水提取物對東莨菪堿模型小鼠學習記憶的影響

孫冠鐸，胡志紅，宋 虎，趙建峰，謝 敏，路西明

?

·基礎醫學·

山茱萸果核水提取物對東莨菪堿模型小鼠學習記憶的影響

孫冠鐸，胡志紅，宋 虎，趙建峰，謝 敏，路西明

目的 探討山茱萸果核水提取物對東莨菪堿所致記憶獲得性障礙小鼠學習記憶能力的影響和機制。方法 60只昆明雄性小鼠隨機分為6組：空白對照組、東莨菪堿模型組、吡拉西坦陽性對照組，山茱萸水提物高劑量組(20 g/kg)、中劑量組(10 g/kg)、低劑量組(5 g/kg)。連續灌胃14 d，進行Morris水迷宮測試各組的學習記憶能力，測試前20 min，除正常對照組腹腔注射生理鹽水外，其余各組均注射東莨菪堿，建立記憶獲得性障礙模型，測試結束后檢測各組血清T-AOC、SOD活性和MDA含量。結果 與模型組相比，山茱萸果核水提取物各組平均逃避潛伏期明顯縮短，血清T-AOC提高，MDA含量降低(P< 0.05)，SOD活性無明顯差異(P>0.05)。結論 山茱萸果核水提取物可改善記憶獲得性障礙模型小鼠的學習記憶能力，其機制可能與山茱萸的抗氧化能力有關。

山茱萸果核水提物；東莨菪堿；學習記憶；抗氧化能力

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸(Cornus Officinalis Sieb et Zucc)的干燥成熟果肉，《本草綱目》記載：“山茱萸，主治心下邪氣寒熱，溫中，逐寒溫痹，去三蟲，久服輕身；有強陰益精、安五臟、通九竅、止小便淋瀝之功；久服明目、強力長年”。現代研究證明山茱萸具有抗氧化、改善記憶、免疫調節、降血糖等作用[1-2]，對于現代社會日益增多的由于衰老、老年癡呆等引起的學習記憶障礙有著重要意義[3]。其果核含有豐富的有機酸、酚類物質、礦質元素和氨基酸，有較好的抗氧化活性，但是其果核提取物的功效報道仍尚少[4-6]。本實驗通過東莨菪堿構建小鼠的記憶獲得性障礙模型，運用Morris水迷宮實驗探討山茱萸果核水提物對記憶獲得性障礙小鼠學習記憶的影響，為果核的藥用開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種小鼠，雄性，體質量18～24 g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號SCXK(鄂)2010-0007。

1.2 藥品與試劑 氫溴酸東莨菪堿(上海禾豐制藥有限公司產品，批號1202038)；吡拉西坦片(宜昌人福藥業有限責任公司，批號3121204)；山茱萸果核由河南科技大學醫學院提供；總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 Morris水迷宮視頻跟蹤系統，成都泰盟科技有限公司研制；臺式高速冷凍離心機，上海天美生化儀器設備工程有限公司，型號CT14RD,編號674009；UV752N紫外可見分光光度計，編號YK1207437。

1.4 山茱萸果核水提取物的制備 稱取山茱萸果核500 g，清洗，烘干，粉碎，加入4倍量的蒸餾水，浸泡24 h，加熱至100℃，30 min，過濾，回收濾液，濃縮至生藥量濃度為1 g/mL。

1.5 動物篩選、分組 采用水迷宮篩選出學習記憶能力相近的昆明小鼠60只，隨機分成6組，每組10只：正常對照組，吡拉西坦陽性對照組(0.8 g/kg)，東莨菪堿模型組，水提物高劑量組(20 g生藥/kg)，水提物中劑量組(10 g生藥/kg)，水提物低劑量組(5 g生藥/kg)。灌胃標準20 mL/kg,正常對照組、模型組灌胃同等體積的蒸餾水，陽性對照組灌胃吡拉西坦。各組自由進食、飲水。各組連續灌胃14 d，每天1次。

1.6 Morris水迷宮定位航行實驗 灌胃14 d后進行Morris水迷宮定位航行實驗。每天水迷宮實驗前1 h進行灌胃，正常對照組、模型組灌胃蒸餾水，陽性對照組灌胃吡拉西坦，其余組按高、中、低劑量灌胃山茱萸水提物；水迷宮實驗開始前20 min進行腹腔注射，除正常對照組腹腔注射等量的生理鹽水外，其余各組按2 mg/kg注射東莨菪堿，建立記憶獲得障礙模型。Morris水迷宮實驗方法參見文獻[7]。圓形水池直徑80 cm，池水混入奶粉形成乳白色，實驗室水溫保持在(24±2)℃。水池上方安置攝像系統，同步記錄小鼠的運動軌跡。水池等分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個象限，圓形平臺放置于第Ⅲ象限中間，低于水面2 cm。每只小鼠每天訓練4次，4個象限各1次。記錄小鼠從入水到找到平臺的時間，即逃避潛伏期，如小鼠在60 s內沒有找到平臺，則人工引導至平臺并停留10 s，潛伏期記為60 s。實驗為期4 d，實驗期間環境及參照物不變。

1.7 血清T-AOC、SOD、MDA的測定 水迷宮實驗結束后，小鼠脫臼處死，眼眶采血，離心取血清，TBA(硫代巴比妥酸)法測定血清丙二醛(MDA)含量，比色法測定總抗氧化能力(T-AOC)水平、黃嘌呤氧化酶法測SOD活性。

2 結果

2.1 對空間學習記憶能力的影響 結果見表1。如表1所示，隨著訓練次數的增加，各組小鼠找到平臺的潛伏期逐漸縮短。與正常對照組相比，模型組小鼠第1天至第3天潛伏期無明顯差異，第4天潛伏期明顯長于對照組(P<0.05)。與模型組相比，在訓練第2天，水提物高、中、低劑量組的潛伏期(18.9±3.26，18.13±8.82，19.6±5.02)明顯短于模型組(34.33±10.77)(P<0.05)；在訓練的第3天，水提物低劑量組的潛伏期(9.32±3.46)比模型組(19.5±7.61)短(P<0.05)；在訓練第4天，水提物高、中、低劑量組的潛伏期(12.79±4.52，10.44±5.77，13.28±5.68)也明顯短于模型組(23.96±9.86)，差異有統計學意義(P<0.05)。與吡拉西坦陽性對照組相比，水提物各組的潛伏期無明顯差異，提示水提物各組能明顯改善模型組的學習記憶能力，效果與吡拉西坦基本相同。

表1 Morris水迷宮定位航行實驗中平均逃避潛伏期的比較

注：①與模型組相比P<0.05；②與對照組相比P<0.05。

3.2 對血清T-AOC、SOD和MDA含量的影響 結果見表2。結果顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清T-AOC明顯下降(P<0.05)，MDA 及SOD活性無明顯差異(P>0.05)。與模型組相比，水提物高、中、低劑量組血清T-AOC含量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；水提物高、中劑量組的血清MDA含量明顯低于模型組(P<0.05)，而SOD活性無明顯差異。提示山茱萸果核水提物能明顯提高血清T-AOC水平，降低MDA含量，尤其以高劑量組效果最為明顯。

表2 血清T-AOC、SOD、MDA含量的比較

注：①與模型組比較P<0.05；②與對照組相比P<0.05。T-AOC:總抗氧化能力；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。

3 討論

由衰老引起的學習記憶障礙問題如老年性癡呆等疾病，隨著現代社會人口的老齡化加深已成為人們關注的焦點。丙二醛(MDA)是體內自由基代謝產生的脂質過氧化物，其含量的高低能間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度及細胞損傷程度，MDA的堆積提示衰老的加深[8-9]。SOD是機體抗氧化損傷防御體系中重要的抗氧化酶，在機體抗氧化損傷中起著重要的作用。T-AOC的高低反映了機體總抗氧化能力的強弱，T-AOC的提高可以減輕體內MDA的堆積。研究表明自由基、脂質過氧化反應與腦老化及認知功能損傷有關[10]。

本實驗通過東莨菪堿建立記憶獲得性障礙模型，急性腹腔注射東莨菪堿可以破壞小鼠的獲得性記憶能力[11]。本研究結果顯示，模型組小鼠第4天的逃避潛伏期明顯長于對照組，說明東莨菪堿所致記憶獲得性障礙模型是比較成功的。通過比較各組小鼠在Morris水迷宮實驗中的平均逃避潛伏期，結果顯示山茱萸水提物高、中、低劑量組均可明顯縮短平均逃避潛伏期，尤其是實驗第2天和第4天，與模型組相比差異具有統計學意義，而與吡拉西坦陽性對照組相比潛伏期無明顯差異，說明山茱萸果核水提物對東莨菪堿所致的記憶障礙具有改善作用，其效果與吡拉西坦基本相同。低劑量組盡管在實驗第3天的潛伏期明顯短于模型組，但第4天的潛伏期有所延長，因此水提物各組的改善作用是否與劑量相關尚待進一步研究。

通過測定小鼠血清T-AOC、SOD和MDA水平，結果顯示山茱萸果核水提取物各組可顯著增強小鼠血清T-AOC水平，降低MDA含量，但T-AOC各劑量組無明顯的劑量依賴性作用，水提物各組間SOD活性比模型組有所增強，但無統計學意義，且也無量效關系，其原因可能與動物個體差異及造模時間較短有關，也可能與水提物中成分復雜有關。實驗結果提示山茱萸果核水提取物能不同程度地增強血清總抗氧化能力。血清抗氧化能力的提高有助于清除機體組織中自由基代謝產物，減輕氧化應激損傷，起到延緩衰老，保護神經細胞免受自由基損傷的作用。

本實驗結果表明山茱萸果核水提物對記憶障礙小鼠的學習記憶能力有改善作用，其機制可能與其抗氧化能力有著密切關系。

[1] 袁菊麗，姜紅波．山茱萸的主要化學成分及藥理作用[J]．化學與生物工程，2011，28(5)：7-9．

[2] 張聰，金德莊．山茱萸的研究進展[J]．上海醫藥，2008，29(10)：464-467．

[3] 于淼，王曉先，賈琳，等．山茱萸的藥理作用研究進展[J]．東南國防醫藥，2010，12(3)：240-243．

[4] 楊柳，王明艷，蔡寶昌．山茱萸抗衰老研究進展[J]．中華中醫藥學刊，2009，27(3)：507-508．

[5] 朱丹，徐少軍，杜梨果，等．山茱萸及其果核的研究現狀[J]．河南科技大學學報:醫學版，2011，29(4)：312-315．

[6] 李曉明，姜華，李軍，等．山茱萸果核中多酚的抗氧化活性研究[J]．時珍國醫國藥，2012，23(4)：902-904．

[7] 何穎，沈先榮，蔣定文，等．方格星蟲對記憶障礙模型小鼠學習記憶能力的影響[J]．中國海洋藥物雜志，2012，31(1)：38-41．

[8] Manczak M，Anekonda TS，Henson E，et al．Mitochondria are a direct site of a beta accumulation in Alzheimer′s disease neurons：implications for free radical generation and oxidative damage in disease progression[J]．Hum Mol Genet，2006，15(9)：1437-1449．

[9] 歐陽石，孫莉莎，郭勝藍，等.知母皂苷元對癡呆模型大鼠的影響[J].第一軍醫大學學報，2005，25(2)：121-126．

[10]Su B, Wang XL,Lee HG, et al．Chronic oxidative stress causes increased tau phosphorylation in M17 neuroblastoma cells[J].Neurosci Lett，2010，468(3)：267-271．

[11]董軍，裘晟，盧大祥，等．姜黃素對東莨菪堿所致小鼠記憶功能障礙的影響[J]．中國病理生理雜志，2009，2(1)：112-117．

Effect of Water Extract from Cornus Officinalis Core on Learning and Memory Ability in Model Mice Induced by Scopolamine

SUN Guan-duo,HU Zhi-hong,SONG Hu,et al

(Medical College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo explore the effect of water extract from cornus officinalis core on learning and memory ability acquired disorder mice induced by scopolamine (SCOP).Methods60 mice were randomly divided into 6 groups：the normal control group, SCOP model group, piracetam group(positive control), high-dose water extract group (20 g/kg), medium-dose water extract group (10 g/kg) and low-dose water extract group (5 g/kg).The normal control group and the SCOP model group had been given a gavage of distilled water and the positive group had been given a gavage of piracetam for 14 days. On the 14th day, Morris water maze test was carried on. 20 minutes before the test, the normal group mice were given an intraperitoneal injection of normal saline ,and the other five groups were injected with SCOP to form a memory disorder model.After the Morris water maze test, the serum samples of all groups were collected to test the T-AOC、SOD and MDA.ResultsCompared with the SCOP model group, the groups which were treated with water extract from cornus Officinalis showed the shorter escape latency to find the hidden platform, and the level of the serum T-AOC increased, while the content of MDA decreased obviously. There were no significant differences in SOD activity among the groups.ConclusionThe water extract from cornus officinalis could improve the learning and memory ability acquired disorder mice, which may be due to the antioxidant capacity of the water extract from cornus officinalis.

cornus officinalis water extract；scopolamine；learning and memory ability；antioxidant

河南省科技攻關計劃項目(082102310031) 河南科技大學大學生研究訓練計劃項目(SRTP)(2011162)

2014-12-18

河南科技大學醫學院，河南洛陽 471003

孫冠鐸(1991-)，男，河南洛陽人，從事神經生理學研究。

胡志紅，女，副教授，E-mail：lyhzh698@163.com

R338.64;R285.5

A

1672-688X(2015)02-0081-03