甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌對萬古霉素藥物敏感性試驗的方法學比較

郭 燕， 蔣曉飛， 朱德妹， 胡付品， 陳淵成， 吳 湜， 楊 洋

·論著·

甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌對萬古霉素藥物敏感性試驗的方法學比較

郭 燕， 蔣曉飛*， 朱德妹， 胡付品， 陳淵成， 吳 湜， 楊 洋

目的 比較不同藥敏試驗方法測定萬古霉素對甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)抗菌活性的影響。方法 收集2013年臨床分離的61株MRSA，采用微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法和E試驗法對MRSA進行萬古霉素藥敏試驗的測定。根據CLSI 2014年版標準進行結果判斷。采用SPSS軟件對3種藥敏試驗所得萬古霉素最低抑菌濃度(MIC)值進行分析。結果 MRSA對萬古霉素的敏感率均為100%，未見萬古霉素不敏感株。微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法測定萬古霉素對MRSA的MIC50和MIC90值均為1 mg/L，采用E試驗法測定的MIC50和MIC90值均為1.5 mg/L。3種藥敏試驗得到的MIC幾何平均值分別為1.01(微量肉湯稀釋法)、0.96(瓊脂稀釋法)和1.30(E試驗法)。結論 3種藥敏方法檢測MRSA對萬古霉素的敏感性結果雖一致，但由于萬古霉素MIC值的細小差異在臨床療效上有著顯著差異，故實驗室為臨床提供萬古霉素藥敏試驗結果時，需要明確指出采用的具體藥敏試驗測定方法。

甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌； 萬古霉素； 微量肉湯稀釋法； 瓊脂稀釋法； E試驗法； 藥物敏感性

萬古霉素為治療甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(金葡菌)(MRSA)感染的首選藥物[1]，但隨著萬古霉素在臨床應用不斷增多，已經出現對萬古霉素敏感性降低的MRSA菌株[2-3]。文獻報道，藥敏試驗方法學可以影響萬古霉素對金葡菌的最低抑菌濃度(MIC)值[4]。本實驗采用微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法和E試驗法測定萬古霉素對61株臨床分離MRSA的MIC值，并對3種方法獲得的結果進行比較分析，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌 收集2013年上海市和全國13所醫院臨床分離的MRSA 共61株，剔除同一患者相同部位重復菌株。細菌主要分離自血液(77.0%)、胸腹水(18.0%)、膽汁(4.9%)等無菌體液標本。所有細菌均于-80 ℃保存，待試驗開始時取出，復蘇和轉種各1次后進行試驗。

1.1.2 抗菌藥物 萬古霉素標準品購自中國食品藥品檢定研究院技術服務部。萬古霉素E試驗條系法國生物梅里埃公司產品，測定的濃度范圍為 0.016～256 mg/L。

1.1.3 培養基 瓊脂稀釋法和E試驗法所用Mueller-Hintor瓊脂(MHA)為OXOID公司產品。微量肉湯稀釋法所用陽離子調節肉湯(Cation Adjusted Mueller Hinton Broth, CAMHB)為BBL公司產品。

1.1.4 DensiCHEK plus比濁儀 系法國生物梅里埃公司產品。

1.1.5 質控菌株 金葡菌ATCC 29213為本研究所菌種庫保存菌株。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗方法

1.2.1.1 微量肉湯稀釋法 按2012年美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)M07-A9(需氧菌的抗菌藥物稀釋法敏感性試驗第9版)[5]推薦的微量稀釋法進行。96孔U底微量板，每孔培養液終體積為100 μL，設置細菌生長孔和空白對照孔。萬古霉素濃度分別為0.06～32 mg/L，細菌接種菌量為105CFU/mL。經35 ℃24 h培養后,用觀察輔助器讀取結果。要求細菌生長孔U型底中出現≥2 mm受試菌生長菌斑，空白對照孔未見細菌生長。受試菌株未見生長的最低一孔萬古霉素濃度即為萬古霉素對MRSA的MIC值。

1.2.1.2 瓊脂稀釋法 按2012年CLSI M07-A9推薦的瓊脂稀釋法進行。萬古霉素受試濃度同微量肉湯稀釋法，接種菌量為104CFU/點，同時設置無抗菌藥物對照生長平皿。35 ℃24 h培養后,肉眼觀察細菌生長，讀取結果。要求無抗菌藥物對照生長平皿上受試菌生長良好。讀取含藥平皿中未見細菌生長最低藥物濃度即萬古霉素對MRSA的MIC值。

其實，何良諸沒有被案子纏上，是狗仔記者嗅到他的。記者跟他掏弄事件背景，何良諸算他媽什么背景。何良諸至今不明案情。剛才，文化廳領導通知他去公安廳。領導沒有多講什么，何良諸沒有多問什么。趙集怎么樣了？！

1.2.1.3 E試驗法 按2012年CLSI M02-A11(紙片法抗菌藥物敏感性試驗第11版)[6]推薦的方法進行。0.5麥氏濁度的MRSA菌液涂布于4 mm厚的MH平皿，待瓊脂吸收后用無菌鑷子貼上萬古霉素E試驗條。35 ℃24 h培養后，E試驗條與抑菌圈相切的藥物濃度標注線即為萬古霉素對MRSA的MIC值。

上述3種藥敏試驗方法為菌液調配好后在同一時間內操作完成。

1.2.2 統計分析 按2014年版CLSI M100-S24[7]描述的萬古霉素對金葡菌的折點(敏感≤2 mg/L，中介4～8 mg/L，耐藥≥16 mg/L)進行藥敏結果判斷。

2 結果

2.1 萬古霉素藥敏試驗

3種藥敏試驗方法測定結果顯示，萬古霉素對61株MRSA的MIC值均≤2 mg/L，細菌敏感率均為100%，見表1。微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法所得萬古霉素MIC值范圍均為0.5～2 mg/L，MIC50和MIC90值均為1 mg/L；而E試驗法得到的萬古霉素MIC 值范圍為0.75～2 mg/L，MIC50和MIC90值均為1.5 mg/L。微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法測定萬古霉素抑制MRSA生長的MIC值的眾數為 1 mg/L，MIC幾何平均值分別為1.01和0.96； E試驗法測定的MRSA的MIC值眾數為1.5 mg/L，MIC幾何平均值為1.30。當萬古霉素MIC值=1 mg/L 時，微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、E試驗法對MRSA累積百分敏感率分別為95.1%(58株)，91.8%(56株)和36.1%(22株)。見表2。

2.2 3種藥敏試驗方法的MIC值趨勢比較

采用SPSS軟件繪制萬古霉素對61株MRSA的MIC值柱狀圖，MIC值集中分布趨勢的排序為: 微量肉湯稀釋法>瓊脂稀釋法>E試驗法，3種方法顯示MIC值為1 mg/L的細菌占總體構成比依次各為91.8%、77.0%和27.9%。E試驗法顯示MIC值為1.5 mg/L的細菌達到54.1%。見圖1。

表1 3種方法測定61株MRSA對萬古霉素的敏感性

表2 3種方法測定萬古霉素對61株MRSA的MIC值分布和累積百分敏感率

(A) broth microdilution method, (B) agar dilution method, (C) E-test.

3 討論

金葡菌，尤其MRSA是醫院獲得性感染的重要病原菌之一。2013年上海市和中國CHINET監測網[8-9]的報道中金葡菌的檢出率分別為10.42% 和9.61% ，分別占全年分離細菌的第3和第5位；在革蘭陽性菌中居首位。MRSA的檢出率分別占金葡菌的50.8%和45.2%。萬古霉素一直以來均作為MRSA感染的首選藥物[1]。

Prakash 等[10]采用微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法和E試驗法比較了101株MRSA的MIC值，E試驗法測定的萬古霉素MIC值有89%～98%為1.5～2 mg/L，而瓊脂稀釋法和微量肉湯稀釋法測定的MIC值僅有3%～12%為2 mg/L。本組資料顯示E試驗法測定萬古霉素對金葡菌的MIC值眾數為1.5 mg/L(54.1%)，MIC幾何平均值為1.30；而微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法所得的萬古霉素MIC值眾數均為1 mg/L(所占比例分別為 91.8%和77%)，MIC幾何平均值分別為1.01和 0.96，與文獻報道一致[10-12]。本文中萬古霉素MIC值結果根據CLSI的判斷顯示均為敏感，3種藥敏試驗方法數值上無大差異；但是由于微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法中抗菌藥物的濃度采用的是幾何級數稀釋,一種倍比率為2的對倍稀釋方法。商品化的E試驗條上的藥物濃度則是算術稀釋，其各個濃度間的差異比幾何稀釋的濃度更小。所以如果根據MIC值眾數(1 mg/L、1 mg/L和1.5 mg/L,P<0.01)和MIC幾何平均值(1.01、0.96和1.30,P<0.01)來判斷，顯示3種藥敏試驗方法或多或少存在一定的差異。Soriano等[13]指出，根據眾多藥效學的研究，萬古霉素濃度曲線下面積/MIC比值(AUC/MIC)是預測臨床萬古霉素治療金葡菌感染療效的最佳方法。當萬古霉素MIC值為2 mg/L時得到的最佳AUC/MIC要比萬古霉素MIC值為1 mg/L 時的最佳AUC/MIC低，這就說明藥敏結果即使有正負一個稀釋度的差異，也會影響AUC/MIC，以致臨床療效上的差異。

由于萬古霉素紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑相似，無法區分萬古霉素敏感金葡菌(VSSA)和萬古霉素中介金葡菌(VISA)，故CLSI 2009年取消紙片法，建議采用稀釋法進行萬古霉素對金葡菌的藥敏試驗[14]。本組資料提示，采用不同的藥敏試驗方法得到的萬古霉素MIC值敏感范圍是不一樣的。對于采用稀釋法的藥敏試驗方法，MIC值結果可以有正負一個稀釋度的浮動[10]。萬古霉素MIC值的細小差異，在臨床療效上有著顯著差異，因此，在為臨床提供萬古霉素藥敏試驗結果時，需要明確指出采用的具體藥敏試驗方法，以避免因方法學不同而帶來的療效差異。

[ 1 ] 中華醫學會感染與抗微生物治療策略高峰論壇：甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌感染的治療策略-專家共識[J].中國感染與化療雜志，2011，11(6)：401-416.

[ 2 ] Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T, et al. Methicillin-resistantStaphylococcusaureusclinical strain with reduced vancomycin susceptibility[J]. J Antimicrob Chemother, 1997, 40 (1): 135-136.

[ 3 ] Hanaki H, Kuwahara-Arai K, Boyle-Vavra S, et al. Activated cell-wall synthesis is associated with vancomycin resistance in methicillin-resistantStaphylococcusaureusclinical strains Mu3 and Mu50[J].J Antimicrob Chemother, 1998,42 (2): 199-209.

[ 4 ] Mason EO, Lamberth LB, Hammerman WA, et al. Vancomycin MICs forStaphylococcusaureusvary by detection method and have subtly increased in a pediatric population since 2005[J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(6)：1628-1630.

[ 5 ] Clinical and Laboratory Standads Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that growAerobically[S]．Approved standard-Ninth edition, 2012,M07-A9.

[ 6 ] Clinical and Laboratory Standads Institute. Performance Standards for antimicrobial disk susceptibility tests [S]．Approved standard-Eleventh edition, 2012,M02-A11.

[ 7 ] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S].Twenty-fourthth informational supplement,2014,M100-S24.

[ 8 ] 胡付品，朱德妹，汪復，等. 2013年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志，2014，14(5)：369-378.

[ 9 ] 胡付品，朱德妹，汪復，等. 2013年上海市細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志，2014，14(6)：461-473.

[10] Prakash V, Lewis JS 2nd, Jorgensen JH, et al. Vancomycin MICs for methicillin-resistantStaphylococcusaureusisolates differ based upon the susceptibility test method used[J]. Antimicrob Agents Chemother,2008，52(12):4528-4529.

[11] Rybak MJ, Vidaillac C,Sader HS, et al. Evaluation of vancomycin susceptibility testing for methicillin-resistantStaphylococcusaureus: comparison of E-test and three automated testing methods[J]. J Clin Microbiol,2013,51(7):2077-2081.

[12] Rossatto FC, Proencal LA, Becker AP, et al. Evaluation of methods in detecting vancomycin mic among MRSA isolates and the changes in accuracy related to different MIC values[J]. Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 2014,56(6): 469-472.

[13] Soriano A,Marco F,Martinez J, et al.Influence of vancomycin minimun inhibitory concentration on the treatment of methicillin-resistantStaphylococcusaureusbacteremia[J]. Clin Infect Dis, 2008,46 (2):193-200.

[14] Clinical and Laboratory Standads Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S]. Nineteenth informational supplement,2009,M100-S19.

Susceptibility of methicillin-resistantStaphylococcusaureusto vancomycin tested by three methods

GUO Yan, JIANG Xiaofei, ZHU Demei, HU Fupin, CHEN Yuancheng, WU Shi, YANG Yang

. (Institute of Antibiotics, Huashan Hospital, Fudan University, Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics, Ministry of Health, Shanghai 200040, China)

Objective To investigate the effect of different testing methods on the susceptibility of methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA) to vancomycin. Methods Sixty-one strains of MRSA were identified from clinical specimens in 2013. The minimum inhibitory concentrations (MICs) of MRSA strains to vancomycin were determined by broth microdilution, agar dilution and E-test methods, simultaneously. Results were analyzed according to the Clinical and Laboratory Standards Institute 2014 breakpoints. SPSS software was used to compare the MIC values obtained by three testing methods. Results All the MRSA strains (100%) were susceptible to vancomycin reported by any of the three testing methods. MIC50and MIC90values of vancomycin against MRSA were 1 mg/L by broth microdilution and agar dilution methods, and 1.5 mg/L by E-test method. The geometric mean MIC value was 1.01 by broth microdilution method, 0.96 by agar dilution method and 1.30 by E-test. Conclusions All MRSA strains are susceptible to vancomycin tested by any of the three testing methods. The testing method should be stated clearly when laboratory provides the result of vancomycin susceptibility.

methicillin-resistantStaphylococcusaureus; vancomycin; broth microdilution method; agar dilution method; E-test method; antimicrobial susceptibility

國家科技部“重大新藥創制”科技重大專項(2012ZX 09303004-001)；復旦大學附屬華山醫院2012年院內啟動基金(院471)。

復旦大學附屬華山醫院抗生素研究所，衛生部抗生素臨床藥理重點實驗室，上海 200040；*檢驗醫學科。

郭燕(1982—)，女，碩士研究生，主管技師，主要從事新抗菌藥物藥效學和細菌耐藥性研究。

朱德妹，E-mail:zhu_dm@fudan.edu.cn。

R378.11；978.1

A

1009-7708(2015)04-0341-04

2015-02-05

2015-02-26