圍絕經期綜合征肝郁大鼠模型的建立及評價*

沈建英 丁珊珊 賴新梅 楊小婷 柯龍 林開敏 楊敏

圍絕經期綜合征指婦女絕經前后由于性激素波動或減少所致的一系列軀體及精神心理癥狀，其中雌激素水平下降是引起該病的主要原因[1-2]。隨著生活水平提高，工作壓力加大，人口老齡化加劇，圍絕經期綜合征的發病率逐年增高。肝氣郁結證是其主要中醫證型，中醫藥治療已經取得較好的療效，而且副作用小[3-4]。目前比較認可的圍絕經期綜合征肝郁模型是運用自然衰老的大鼠進行造模，然而由于其飼養周期長，成本高，來源非常稀少，因此相關的研究報道相對較少，中醫藥對其作用機制的了解受到很大的局限[5-6]。而去勢大鼠也是公認的圍絕經期綜合征模型，其陰道脫落細胞涂片及血清性激素水平均和圍絕經期發生的改變相似[7-8]。因此本研究擬用去勢大鼠模型，聯合慢性束縛應激與孤養法進行造模，從外觀特征及行為學水平來探討該模型的有效性，為進一步探討中醫藥治療圍絕經期綜合征肝郁的科學內涵提供基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康雌性SD大鼠24只，體質量（220±20）g，清潔級，動物許可證號為SCXK （京） 2002-2009，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供。光/暗周期為12 h/12 h（光照時間6：00-18：00），室溫（22±2）℃，相對濕度保持為30%~40%，喂常規顆粒飼料及飲用水。適應性飼養兩周后，利用敞箱實驗對每只大鼠進行行為學評分，水平運動和垂直運動總得分低于40分和高于160分的動物予以剔除，選擇各項行為學指標得分相近的24只大鼠，按體質量分層采用隨機數字表法將大鼠隨機分為假手術組、去勢空白組、去勢模型組，每組各8只，組間體質量及曠場評分比較差異無統計學意義（P<0.05）。

1.2 模型的建立 （1）去勢：動物分組后行去卵巢手術。手術前，兩組大鼠均禁食12 h，按體質量腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，模型組從腹部正中線切口，切除雙側卵巢，假手術組不切除卵巢，只將卵巢旁與卵巢等大的一塊脂肪組織切除。動物手術后自然修復兩周，在慢性束縛應激前進行連續5 d陰道涂片檢測，觀察無成熟脫落細胞，證明卵巢切除完整，造模成功。假手術組動物的陰道脫落細胞依然呈典型的周期性變化。（2）慢性束縛：用慢性束縛應激結合孤養法建立肝郁證大鼠模型，將去勢模型組大鼠置于束縛筒內，管壁有若干通風口，通風良好，大鼠能夠自由呼吸，束縛應激時間為6 h（9：00-15：00），連續束縛21 d，束縛應激期間禁食禁水。假手術組和去勢空白組在同一時段內也是禁食禁水。（3）孤養：去勢模型組單籠飼養，假手術組和去勢空白組群養，4只/籠。

1.3 體質量與行為學檢測

1.3.1 外部特征及體質量 每天造模前觀察并記錄各組大鼠的飲食、二便、毛發色澤、情緒行為等外觀方面的變化。分別于手術前1天，應激前1天，應激第7、14、21天上午8：00-9：00記錄各組大鼠體質量。

1.3.2 曠場實驗 于動物分組前、應激前1天和應激第21天8：00-12：00進行測試。采用自制長×寬×高=75 cm×75 cm×40 cm的敞箱，底面劃分成25個面積相等的方格。曠場的中央放一彩色瓶子激發大鼠的好奇心。拍攝并記錄5 min內大鼠的水平運動格數（四爪皆進入記為1分）和垂直豎立次數（兩前爪騰空或攀附箱壁記為1分）。每只大鼠均從同一角落放入，測評結束后，及時記錄糞便顆粒數，并用75%酒精擦拭以消除氣味的影響，待酒精晾干后再進行下一次實驗。

1.3.3 糖水偏好實驗 分別在分組前、造模前和造模結束后檢測各組大鼠的糖水消耗率。按照文獻[9]的方法進行部分修改，實驗進行時，每只大鼠單籠喂養，實驗前，訓練實驗大鼠適應含糖飲水12 h（20：00-次日8：00），10 h禁食禁水后，同時給予1%蔗糖水和純水各1瓶，1 h后調換蔗糖水和純水的位置，2 h后分別稱量純水消耗量及蔗糖水消耗量，計算糖水消耗率（糖水消耗率=糖水消耗量/總液體消耗量×100%）。

1.4 統計學處理 使用SPSS 19.0軟件，計量資料采用（±s）表示，對所得一般性數據做正態分布檢驗和組間方差齊性檢驗，其中體質量、糖水消耗率、曠場實驗的水平得分及垂直得分符合正態分布和方差齊性，用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗進行分析；曠場實驗中的修飾得分、糞便數目不符合正態分布則采用采用非參數檢驗進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組外部特征及體質量變化比較 造模前，各組大鼠活潑好動，皮毛光澤好、糞便呈球形。造模結束后，大鼠毛發變得干枯、胡須下搭、行動遲緩、精神倦怠、嗜臥、進食進水量減少、大便稀軟。各組大鼠在行去勢手術前體質量比較差異無統計學意義（P>0.05）。去勢后兩周即應激前1天，與假手術組相比，兩個去勢組的大鼠體質量均顯著增加，差異有統計學意義（P<0.01）。于應激第7、14、21天，和去勢空白組相比，去勢模型組的體質量均顯著下降，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01）；應激第21天，去勢模型組的體質量甚至低于假手術組，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05），見表 1。

2.2 三組對曠場行為的影響比較 手術前，各組大鼠在基線水平的水平得分和垂直得分差異均無統計學意義（P>0.05）；手術后兩周，即應激造模前1天，和假手術組比較，去勢空白組和去勢模型組大鼠的水平活動得分均有顯著下降（P<0.01）；應激造模結束后，與假手術組相比，去勢空白組和去勢模型組大鼠的水平活動得分均進一步顯著下降，差異有統計學意義（P<0.01）。在垂直得分的分析結果中發現，僅去勢模型組大鼠在應激結束后，其得分和假手術組及去勢空白組相比發生顯著性下降，差異有統計學意義（P<0.01），見表2。各組大鼠的修飾次數和糞便顆粒經秩和檢驗，差異均無統計學意義（P>0.05），但是去勢模型組的修飾次數有減少的趨勢，糞便顆粒數有增加的趨勢（數據未列出）。

表1 慢性束縛應激對各組大鼠體質量的影響（x-±s） g

表2 慢性束縛應激對各組大鼠曠場行為的影響比較（x-±s） 分

2.3 各組對糖水偏好的影響比較 手術前，各組大鼠在基線水平的糖水消耗率比較差異無統計學意義（P>0.05）；手術兩周后，即應激造模前，和假手術組比較，去勢空白組和去勢模型組的糖水消耗率均明顯下降，差異均有統計學意義（P<0.05）；應激造模結束后，和假手術組相比，去勢空白組與去勢模型組糖水消耗率均顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05，P<0.01），去勢模型組的糖水消耗率顯著低于去勢空白組，兩組比較差異有統計學意義（P<0.01），見表3。

表3 慢性束縛應激對各組大鼠糖水偏愛率的影響（x-±s）%

與假手術組比較，*P<0.01，**P<0.05；△與去勢空白組比較，P<0.01

3 討論

課題組前期研究結果表明，肝郁是圍絕經期綜合征的重要病理因素[4]。圍絕經期女性常面臨家庭及事業等多種問題，精神壓力較大，多感所愿不遂、抑郁于內，易形成心理應激。因此，建立圍絕經期綜合征肝郁動物模型對于本病機理的深入研究具有一定的現實意義。本文通過手術摘除卵巢人為地造成雌激素突然下降模擬圍絕經期綜合征的狀態，該方法周期短、簡單易行，是常用的一種圍絕經期綜合征造模方法[8]。目前普遍認為，肝郁多表現為認知、人格等心境障礙，病理反應涉及植物神經功能紊亂，神經內分泌免疫等調節網絡的失衡[10]。多數學者認為，肝主疏泄的功能與心理—應激反應有關，從心理—應激反應來研究肝郁是近幾年的研究熱點[11-12]。慢性束縛應激使動物自由行動受限，情緒受抑，比較接近中醫“情志不遂”致郁的發病學說；孤養則模擬了人類遠離社會、家庭的生存狀態，運用束縛制動聯合孤養法建立肝郁大鼠模型，可以制造較為純粹的挫折應激和孤獨感受，是較好的負性心理應激動物模型[13-14]。另外，因其軀體應激因素較小，對機體無損傷性刺激，與人類身心性疾病的致病過程類似，近年來在肝郁相關研究中已被廣泛采用[15-16]。本研究表明，去勢模型組大鼠體重增加緩慢，探究行為減少，表現出情緒低落、興趣減退等癥狀，與圍絕經期綜合征肝郁證的形成過程相似。

圍絕經期女性由于卵巢萎縮，雌激素分泌下降，糖和脂肪代謝發生紊亂，體脂分布異常，特別是腹內脂肪積聚[14]。在本研究中大鼠在去勢手術后兩周體質量顯著增加，該現象與女性在圍絕經期的體質量變化相吻合。在束縛應激條件下，腎上腺皮質醇顯著升高，機體對胰島素的敏感性增加，皮質醇還可以促進蛋白質分解，抑制其合成，同時影響糖和脂類的代謝[17]。因此本研究中去勢模型組在應激開始后，體質量幾乎沒有增長，甚至有下降的趨勢。

在行為學研究中，曠場實驗可以用來檢測動物在新奇環境中的活動度、探究行為、恐懼緊張狀態及警覺性，其中水平活動反映動物的活動度，垂直活動反映動物對新鮮環境的好奇程度，糞便粒數是大鼠緊張程度的表現[18]。肝氣郁結證核心癥狀之一是“快感缺失”，糖水偏好實驗則是用來檢驗動物對幸福事件反應能力的變化，糖水消耗量及偏嗜度降低，表明動物對獎勵敏感度低，常作為一項反映動物愉悅體驗能力的指標[19-20]。本研究表明，大鼠在去勢后，水平運動得分及糖水消耗率明顯下降，在慢性束縛應激結合孤養的作用下，去勢模型組大鼠的行為活動進一步減少、糖水消耗率進一步降低，提示僅僅去勢即會使大鼠活動度、好奇程度及獎賞反應的敏感度下降，但是肝郁造模后大鼠的各癥狀加劇，快感缺乏，興趣喪失，可能是由于大鼠卵巢切除后，生殖內分泌功能開始衰退，對抗應激損傷的能力降低，腦內獎賞系統的一些神經元發生結構性損傷所致。

綜上所述，采用去勢及慢性束縛應激聯合孤養三步法復合制作圍絕經期綜合征肝郁大鼠模型，可以有效地模仿女性圍絕經期由于卵巢功能衰退引起的情感障礙、情緒低落的臨床表現。但是值得注意的是，在研究過程中發現，慢性應激誘導行為改變的易感性存在較大的個體差異，該方法并不能實現百分之百的成功率，因此研究過程中，必須適當增加樣本例數[21]。另外，圍絕經期綜合征肝郁的病理機制涉及神經內分泌免疫等調節網絡，運用現代分子生物學技術進一步闡明其發生發展機制，將為圍絕經期綜合征肝郁的臨床治療提供理論基礎。

[1]孫雪艷，傅萍，李芳，等.中醫藥治療圍絕經期綜合征的實驗研究進展[J].中華中醫藥學刊，2010，29（9）：1930-1932.

[2]李日蘭.圍絕經期綜合征發病機制及雌激素替代治療研究進展[J].中國醫學創新，2011，8（26）：194-195.

[3]喬明琦，徐旭杰.經前期綜合征證候分布規律的流行病學調查研究[J].中國中醫基礎醫學雜志，1997，3（3）：31-33.

[4]張凌媛，康潔，丁珊珊，等.圍絕經期綜合征患者舌苔脫落細胞EGFR表達與中醫肝郁分級相關性的研究[J].中國醫學創新，2014，11（6）：14-16.

[5] Chen S J，Asakawa T，Ding S S，et al.Chaihu-Shugan-San administration ameliorates perimenopausal anxiety and depression in rats[J].Plos One，2013，8（8）：724 28.

[6]李生強，李亞嬋，梁文娜，等.柴胡疏肝散對圍絕經期綜合征肝郁證大鼠模型海馬ERK1/2的影響[J].中華中醫藥雜志，2014，29（10）：3201-3204.

[7]孫靜汾，趙燁，吳素慧.圍絕經期綜合征實驗動物模型的比較分析[J].山西醫科大學學報，2007，38（1）：43-45.

[8]辛明蔚，劉雁峰.大鼠模型在更年期綜合征中西醫實驗研究中的應用概述[J].環球中醫藥，2013，6（10）：764-769.

[9] D'Aquila P S，Brain P，Willner P.Effects of chronic mild stress on performance in behavioural tests relevant to anxiety and depression[J].Physiol Behav，1994，56（5）：861-867.

[10]王愛成，王玉來，陳錦鋒，等.肝氣郁結證的理論與實驗研究概述[J].遼寧中醫學院學報，2005，7（1）：74-75.

[11]嚴燦，徐志偉，吳麗麗，等.建立中醫情志致病動物模型的思考[J].中國臨床康復，2006，10（3）：155-157.

[12]李曉紅，李晶晶，劉明蕓，等.從慢性應激探討肝郁脾虛證的中樞神經生物學機制[J].中西醫結合學報，2012，10（1）：1-6.

[13]謝興振，遲曉麗，周文霞，等.應激動物模型研究進展[J].中國新藥雜志，2008，17（16）：1375-1380.

[14] McInnes K J，Corbould A，Simpson E R，et al. Regulation of adenosine 5'，monophosphate-activated protein kinase and lipogenesis by androgens contributes to visceral obesity in an estrogen-deficient state[J].Endocrinology，2006，147（12）：5907-5913.

[15]宋春紅，高杰，陳志恒，等.經前期綜合征肝氣郁證大鼠下丘腦ERβ的表達及配體受體結合活性的研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2013，24（2）：125-129.

[16]魏盛，張惠云.經前期綜合征肝氣逆、郁兩證大鼠模型建立及宏觀評價方法初探[J].實驗動物與比較醫學，2009，29（3）：142-146.

[17]遲強，許鵬，盧山，等.慢性束縛應激動物模型生物學特性及相關機制研究進展[J].臨床軍醫雜志，2013，41（12）：1299-1301.

[18] Roy M，David N，Cueva M，et al.A study of the involvement of melanin-concentrating hormone receptor 1 （MCHR1） in murine models of depression[J].Biol Psychiatry，2007，61（2）：174-80.

[19]趙海濱，劉子旺，張秀靜.電針肝俞、期門對肝氣郁結模型大鼠行為學的影響[J].廣州中醫藥大學學報，2012，29（1）：30-33.

[20] Green A D，Barr A M，Galea L A.Role of estradiol withdrawal in 'anhedonic' sucrose consumption：a model of postpartum depression[J].Physiol Behav，2009，97（2）：259-265.

[21] Grootendorst J，de Kloet ER，Vossen C，et al.Repeated exposure to rats has persistent genotype-dependent effects on learning and locomotor activity of apolipoprotein E knockout and C57Bl/6 mice[J].Behav Brain Res，2001，125（1-2）：249-259.