加味宮外孕II號方對早孕大鼠滋養細胞凋亡因子Bax、Bcl-2的影響

鄭文蘭，楊江燕，謝 智，文曉敏

(1.貴陽中醫學院第一附原醫院，貴州 貴陽 550001；2.貴州省綏陽縣中醫醫院，貴州 綏陽 550001)

加味宮外孕II號方對早孕大鼠滋養細胞凋亡因子Bax、Bcl-2的影響

鄭文蘭1，楊江燕2，謝 智1，文曉敏1

(1.貴陽中醫學院第一附原醫院，貴州 貴陽 550001；2.貴州省綏陽縣中醫醫院，貴州 綏陽 550001)

目的 探索加味宮外孕Ⅱ號方對早孕大鼠滋養細胞凋亡因子Bax(促凋亡基因)、Bcl-2(抗凋亡基因)的影響。方法 將造模成功的早孕大鼠隨機分為6組：西藥組(甲氨蝶呤組)、中西藥結合組(甲氨蝶呤和加味宮外孕Ⅱ號方)、中藥加味宮外孕Ⅱ號方低、中、高劑量組和空白組(生理鹽水)，分別給予甲氨蝶呤1次肌注、中藥或生理鹽水每天灌胃1次，連續7 d，用藥后第8 d處死孕鼠取出其子宮及孕囊，用免疫組化法檢測滋養細胞凋亡因子Bax、Bcl-2的表達。結果 5個實驗組孕鼠滋養葉細胞Bcl-2評分降低，Bax評分升高，Bcl-2/Bax比值下降，與空白組比較均有差異(P<0.05)；而中西藥結合組變化最明顯，與其他幾組比較有差異(P<0.05)，中藥高、中劑量組、西藥組間比較無差異，P>0.05，但與中藥低劑量組比較有差異(P<0.05)。結論 加味宮外孕II號方和甲氨蝶呤均可通過降低妊娠大鼠滋養葉細胞的Bcl-2、升高Bax的表達，使Bcl-2/Bax比值下降從而促進細胞凋亡，達到殺胚的目的；且中西醫結合效果最好，中藥隨劑量增加，殺胚作用逐漸加強。

加味宮外孕Ⅱ號方；滋養細胞；細胞凋亡；實驗研究

異位妊娠是婦科常見的急腹癥，發病率約為1%，并有逐年增加趨勢[1]，嚴重者可引起患者失血性休克，甚至死亡，病死率占孕婦死亡總數的9 %～10 %[2]。本院多年來一直致力于異位妊娠中西醫結合治療的臨床研究，取得較滿意的治療效果，實驗研究結果表明，活血殺胚消癥中藥可以通過改變早孕大鼠滋養細胞的超微結構、分泌功能、促使炎細胞浸潤，致胚胎發育停滯而起殺胚作用[3]。鄧高丕等研究提示：化瘀消癥中藥可通過下調滋養葉細胞抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，降低Bcl-2/Bax比值，從而促進滋養細胞凋亡的途徑起到治療輸卵管妊娠的作用[4]。為探索本院治療異位妊娠所用方(加味宮外孕Ⅱ號方)對滋養細胞凋亡的影響，本研究以早孕大鼠為模型，檢測經加味宮外孕Ⅱ號方干預后的大鼠滋養細胞凋亡相關因子的表達，結果報道如下。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠共110只，性成熟未生育雌性大鼠80只(體重260±10)g；性成熟雄性大鼠30只(體重280±10)g；由第三軍醫大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-(渝)2012-0005。

1.2 藥物與試劑 加味宮外孕II號方組成：丹參15 g，桃仁9 g，赤芍15 g，莪術9 g，三棱9 g，全蝎10 g，土鱉蟲10 g，蜈蚣9 g，紫草25 g；以上中藥購于貴州省中醫院；稱取上藥后，水煎、過濾、濃縮成每毫升各含生藥6 g(高劑量)、3 g(中劑量)、1.5 g(低劑量)的3種藥液，分別裝瓶標記，置于4℃冰箱冷藏備用。注射用甲氨喋呤(MTX)，5 mg/瓶，生產批號H14022462，山西普德藥業有限公司生產；鼠抗人Bcl-2單克隆抗體及鼠抗人Bax單克隆抗體均購自廣州深達生物制品技術有限公司。

2 方法

2.1 動物模型制備 現有的文獻資料未發現有建立異位妊娠動物模型的方法。本研究用早孕大鼠作為實驗模型，造模方法參照《藥理實驗方法學》[5]。所有雌鼠連續行陰道脫落細胞涂片檢查2周，剔除無動情周期雌鼠16只，入組有規律動情周期的雌鼠64只；將雄鼠與雌鼠按1：1比例合籠過夜，次日清晨取雌鼠陰道分泌物行光鏡檢查，如發現精子即為妊娠第1 d。

2.2 動物分組與給藥 將交配成功的雌鼠隨機編號分為6組：西藥組、中西藥結合組和中藥低、中、高劑量組、空白組。經計算，每只大鼠加味宮外孕II號方給藥劑量為0.777 mL/100 g/d，MTX給藥劑量為0.7775mg/100 g。給藥的時間為09：00-10：00。

2.2.1 西藥組 妊娠第1 d按0.7775mg/100 g體重肌注MTX，1次為1療程，以后不再給藥，并同時按0.777 mL/100 g體重予生理鹽水灌胃，1次/d。

2.2.2 中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組 妊娠第1 d按0.777 mL/100 g體重分別給予高劑量、中劑量、低劑量的加味宮外孕Ⅱ號方灌胃，1次/d。

2.2.2 中西藥結合組 妊娠第1 d予中劑量加味宮外孕Ⅱ號方灌胃及MTX肌注。方法同西藥組及中藥中劑量組。

2.2.3 空白組 妊娠第1 d按0.777 mL/100 g體重予0.9%生理鹽水灌胃，1次/d。中藥及生理鹽水灌胃均連續用7 d。

2.3 Bcl-2、Bax的檢測

2.3.1 孕鼠妊娠子宮標本的采集 孕鼠第7 d晚8∶00開始禁飲食，次日8：00處死大鼠后迅速取出子宮并置于4%多聚甲醛固定24 h，制成石蠟切片。

2.3.2 Bcl-2、Bax的檢測 將上述石蠟切片脫蠟、水化后采用免疫組化法檢測滋養葉細胞凋亡因子Bcl-2、Bax的表達。嚴格按照Bcl-2、Bax試劑盒操作說明進行操作。Bcl-2、Bax診斷評分標準參照文獻[6]擬定。隨機選擇10個高倍視野，計算陽性細胞的百分率，根據染色強度和陽性細胞百分數分為：在細胞內無棕黃色顆粒為陰性(-)記0分；在<50%的細胞內有棕黃色顆粒為弱陽性(+)記1分；在≥50%的細胞內有較淺的棕黃色或在<50%的細胞內有明顯較深棕黃色顆粒為陽性(++)記2分；在≥ 50%的細胞內有明顯較深的棕黃色顆粒為強陽性(+++)記3分。求每例10個高倍視野評分的平均值。

2.4 統計學分析 采用SPSS17.0統計軟件分析實驗數據，P<0.05為差異有統計學意義

3 結果

3.1 滋養細胞Bcl-2表達評分 與空白組比較，5個實驗組大鼠妊娠滋養葉細胞Bcl-2表達評分均下降，P<0.05；中西藥結合組和中藥高劑量組下降最明顯，分別與另外3個實驗組比較有差異，P<0.05；中西藥結合組和中藥高劑量組間比較無差異，P>0.05；西藥組和中藥中劑量組比較無差異，P>0.05；與中藥低劑量組間比較有差異，P<0.05。詳見表1。

表1 6組孕鼠滋養細胞Bcl-2表達評分的比較±s)

3.2 滋養細胞Bax表達評分及Bcl-2/Bax比值 與空白組比較，5個實驗組大鼠滋養細胞Bax表達評分均有上升，P<0.05；而中西藥結合組和中藥高劑量組上升最明顯，分別與另外3個實驗組比較有差異，P<0.05；前2組間比較無差異，P>0.05，西藥組與中藥中、低劑量組間比較無差異，P>0.05。

Bcl-2/Bax比值：和空白組相比，另外5組Bcl-2/Bax比值均降低，P<0.05；其中中西藥結合組與其他4個用藥組比較有差異，P<0.05；中藥高劑量組、中藥中劑量組、西藥組間比較無差異，P>0.05，但與中藥低劑量組比較有差異，P<0.05。詳見表2。

表2 6組孕鼠滋養細胞Bax表達評分及Bcl-2/Bax比值的比較

4 討論

中醫認為，異位妊娠的病機是少腹血瘀實證，其治則為活血殺胚消癥。本院以活血殺胚消癥法為立方依據擬定的經驗方即加味宮外孕Ⅱ號方，方藥組成：丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術、蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、紫草等。方中丹參有活血祛瘀、涼血消癰、除煩安神之功。赤芍具有清熱涼血、消癥止痛的功效，桃仁有活血祛瘀推陳致新之功，三棱、莪術均有破血行氣、消積止痛之功，蜈蚣、全蝎有攻毒散結、通絡止痛之功。土鱉蟲有破血逐瘀之功效，紫草長于涼血活血。全方共奏活血化瘀、殺胚消癥之功效。鄭文蘭等[3]研究認為該方可使早孕大鼠滋養葉細數量、超微結構及分泌功能發生明顯變化，從而導致胚胎死亡。

細胞凋亡是由基因編碼決定的細胞主動死亡，其啟動和進程受一定程序的控制。其中抗凋亡蛋白 Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在細胞凋亡通路中起著重要的調節作用。Bcl-2/Bax蛋白的比值決定了細胞存活或凋亡，Bcl-2>Bax，細胞趨于存活；Bcl-2

[1]豐有吉，沈鏗.婦產科學[M].北京：人民衛生出版社，2013：70-71.

[2]Berg CJ，Atrash HK，Koonin LM，et al.Pregnancy-related morality in the United States，1987-1990.Obstet Gynecol，1996，88(1)：161.

[3]鄭文蘭，趙春梅，楊江燕.活血殺胚消癥法對早孕大鼠妊娠滋養細胞影響的實驗研究[J].云南中醫中藥雜志，2013，(10)：60-61.

[4]鄧高丕，袁爍.化瘀消癥殺胚復方含藥血清對體外培養輸卵管妊娠滋養細胞凋亡的影響[J].中華中醫藥雜志，2012，27(4)：1003-1007.

[5]徐淑云，卞職濂，陳修，等.藥理實驗方法學[M].北京：人民衛生出版社，1991.1313-1314.

[6]張婷，呂東，王鳳蓮.細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2在子癇前期患者胎盤滋養細胞中的表達及意義[J].泰山醫學院學報.2011，32(4)：264-266.

[7]王衛東.Bcl-2/Bax比率與細胞“命運”[J]。中國腫瘤生物治療雜志，2007，14(4)：393-396.

鄭文蘭(1963-)，女，貴州人，研究方向：中西醫結合婦科。

R285.5

A

1007-2349(2015)12-0073-02

2015-09-29)