高效液相色譜法測定小兒導赤片中大黃素和大黃酚的含量*

徐士奎，張雯潔，羅艷秋，陶 靜

(1.云南省食品藥品檢驗所，云南 昆明 650011；2.云南中醫學院，云南 昆明 650500；3.昆明醫科大學，云南 昆明 650500)

高效液相色譜法測定小兒導赤片中大黃素和大黃酚的含量*

徐士奎1，張雯潔1，羅艷秋2，陶 靜3

(1.云南省食品藥品檢驗所，云南 昆明 650011；2.云南中醫學院，云南 昆明 650500；3.昆明醫科大學，云南 昆明 650500)

目的 建立小兒導赤片中大黃素、大黃酚含量測定的高效液相色譜法；方法 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸水溶液(79：21)為流動相，檢測波長為254nm；結果 大黃素在4.072-40.72μg/ml范圍內線性關系良好，平均回收率為95.84%；大黃酚在10.41-104.142μg/ml范圍內線性關系良好，平均回收率為96.40%。結論 HPLC法能準確進行定量分析大黃素和大黃酚兩種物質的含量。

小兒導赤片；大黃素；大黃酚；高效液相色譜

小兒導赤片是由大黃、梔子、滑石、地黃、甘草、木通、茯苓等7味藥材加工制成的純中藥制劑，有清熱利便的功效，治療口舌生瘡、咽喉腫痛、牙根出血、腮頰腫痛、爆發火眼、大便不利、小便赤黃等病癥[1]，療效顯著。方中大黃苦寒瀉下，蕩滌胃腸積滯，為君藥；木通上清心經之熱，下則清利小腸，梔子清熱瀉火，為臣藥；地黃涼血滋陰，為佐藥；生甘草清熱解毒，調和諸藥，為使藥。現收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方制劑第十九冊，原質量標準僅包括性狀、鑒別、檢查、功能主治、用法用量、貯藏等項目，其中鑒別為大黃對照藥材薄層色譜法[1]。原標準嚴重缺項，未能夠有效控制藥品質量，需要對其質量標準進行深入研究。肖培云等[2]曾經運用高效液相色譜法對小兒導赤片中大黃素和大黃酚進行含量測定研究，筆者對其方法進行驗證，發現該方法重現性差且色譜峰的峰形和分離度等均達不到《中國藥典》[3]方法學研究的要求，其樣品測定結果僅為大理白族自治州中藥制藥有限責任公司1家企業樣品，無法反映小兒導赤片的整體質量狀況。為更好的保證藥品質量，筆者重新建立高效液相色譜法對小兒導赤片中大黃素、大黃酚同時進行含量測定研究。

1 儀器、試藥與樣品

1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)，檢測器：SPD-20A(D2+W))；紫外分光光度計(島津UV-2550)；分析天平(Denver TB-215D，十萬分之一)；分析天平(SartorIUS BS224S，萬分之一)

1.2 試藥 對照品為大黃素(中國藥品生物制品檢定所，110796-201017，100%)、大黃酚(中國藥品生物制品檢定所，110756-200110，99.6%)；方法學研究用小兒導赤片樣品均由云南白藥集團麗江藥業提供；甲醇由Merck公司生產，色譜純；水為超純水；磷酸為分析純；乙酸乙酯、無水乙醇、95%乙醇、三氯甲烷等均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸水溶液(79：21)為流動相，檢測波長為254 nm，理論板數按大黃素峰計算應不低于2000。

2.2 對照品貯備溶液的制備 精密稱取大黃素對照品5、09 mg，大黃酚對照品13.07 mg，置50 mL容量瓶中，加無水乙醇-乙酸乙酯(2：1)混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備溶液。對照品HPLC圖譜見圖1。

圖1 對照品HPLC色譜圖

2.3 供試品溶液制備 取小兒導赤片樣品20片，精密稱定重量，研細，精密加入95%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，置水浴上加熱回流1 h，冷卻，用95%乙醇補足減失的重量，濾過，精密量取濾液10 mL至燒瓶內，置水浴上蒸干，殘渣加30%的乙醇-鹽酸(10：1)混合溶液15 mL，加熱回流提取1 h，立即冷卻，用三氯甲烷強烈振搖提取4次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，置水浴上蒸干，殘渣用無水乙醇-乙酸乙酯(2：1)混合溶液溶解，移至25 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得。樣品HPLC圖譜見圖2。

圖2 樣品HPLC色譜圖

2.4 陰性供試品溶液制備 按處方量取缺大黃的其余藥材模擬制劑工藝制備陰性樣品，由云南白藥集團麗江藥業制備。取小兒導赤片缺大黃的陰性樣品20片按2.3項下供試品溶液制備方法制備陰性供試品溶液。陰性樣品HPLC圖譜見圖3。

圖3 陰性樣品HPLC色譜圖

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 分別精密吸取儲備液，加無水乙醇-乙酸乙酯(2：1)溶液制成分別含大黃素濃度為4.072、8.144、10.180、20.36、30.54、40.72 μg/mL，大黃酚濃度為10.414、20.828、26.035、52.071、78.100、104.142 μg/mL的混合對照品溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。以對照品濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，大黃素的回歸方程為Y=38.6x+0.0362，r=0.9999，表明大黃素在4.072-40.72 μg/mL范圍內線性關系良好；大黃酚的回歸方程為Y=53.731x+5.8485，r=0.9999，表明大黃酚在10.414-104.142 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5.2 儀器精密度實驗 取同一對照品溶液(大黃素濃度為10.180 μg/mL，大黃酚濃度為26.035 μg/mL)，按照2.1項下的液相色譜條件重復進樣6次(n=6)，每次進樣10 μL，大黃素和大黃酚峰面積的RSD值分別為0.03%與0.02%，均<2%，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩定性實驗 精密稱取小兒導赤片細粉0.5008 g，按2.3項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL分別在室溫下放置0、2、6、9、13、17 h后進樣，按照2.1項下的色譜條件依法測定，大黃素和大黃酚的RSD分別為0.44%與0.50%，表明供試品溶液在17 h內基本穩定。

2.5.4 重復性實驗 精密稱取同一批次小兒導赤片樣品細粉6份，按2.3項下供試品溶液制備方法處理后進行含量測定，按照外標法計算各樣品中大黃素和大黃酚的含量，RSD值分別為1.83%和1.82%，說明重復性良好。

2.5.5 耐用性試驗

2.5.5.1 提取溶劑的選擇 取樣品分別采用50%乙醇、50%甲醇、70%乙醇、95%乙醇進行提取，結果顯示甲醇與95%乙醇的提取效果明顯優于50%乙醇、50%甲醇、70%乙醇，而甲醇和95%乙醇之間無明顯差別，且甲醇對人視覺有傷害，95%乙醇價格相對便宜，故選用95%乙醇。

2.5.5.2 提取方法與提取時間優化 比較超聲提取30 min、超聲提取1 h、回流提取30 min、回流提取1 h、冷浸12 h、冷浸24 h等提取條件，結果超聲提取1 h、冷浸24 h、回流提取30 min的提取率明顯低于回流提取1 h，故選擇加熱回流提取的方式進行提取；通過比較回流提取30 min、1、2 h等不同提取時間的提取效率，發現回流提取1 h與2 h的提取效果明顯優于30 min，而提取1 h與提取2 h的提取效果基本無差別，表明回流處理1 h能提取完全。

2.5.5.3 色譜條件的優化 取樣品溶液，分別采取不同比例的流動相進行測定，結果表明以甲醇-0.1%磷酸水溶液(79：21)為流動相時被測成分色譜峰的分離度及峰形較好；對不同品牌、不同規格的色譜柱及不同柱溫進行優化測定，結果表明對被測成分色譜峰的分離度及測定結果無明顯影響。

2.5.6 回收率試驗 精密稱取含量已知的小兒導赤片細粉6份，分別置于具塞錐形瓶中，分別精密加入大黃素、大黃酚對照品適量，按2.3項下供試品溶液制備方法及2.1項下的色譜條件依法測定含量并計算回收率，大黃素平均回收率為95.84%，RSD=0.62%；大黃酚平均回收率為96.40%，RSD=0.98%，表明該方法的回收率良好，結果見表1、表2。

2.6 樣品測定 目前生產小兒導赤片主要有長春人民藥業集團有限公司、大理白族自治州中藥制藥有限公司、廣西天天樂藥業股份有限公司、云南白藥集團麗江藥業有限公司等四家生產企業，為充分了解各家企業生產小兒導赤片的質量狀況，課題組對4家企業共10批次樣品進行含量測定研究，結果見表3。

表1 大黃素回收率結果

表2 大黃酚回收率結果

表3 樣品含量測定結果

3 結果與討論

3.1 本實驗采用HPLC法同時測定小兒導赤片中大黃素、大黃酚的含量，該方法分離度好，靈敏度高且穩定性好，可作為其質量控制方法。

3.2 本實驗對目前生產小兒導赤片的4家生產企業提供的樣品進行測定研究，發現小兒導赤片的含量不僅在各家企業之間存在較大差距，而且同一企業生產的不同批次樣品也存在一定差異，非常有必要對其質量標準進行提高研究。

3.3 大黃素在289 nm出現最大吸收峰，大黃酚在254 nm處有最大吸收，但驗證發現254 nm處與289 nm處的吸收峰比較接近，樣品溶液的信號響應值在254 nm時強于289 nm時，且其他成分在254 nm波長處測定無干擾，靈敏度較高，故測定波長選定為254 nm。

[1]中華人民共和國衛生部.藥品標準中藥成方制劑第十九冊，1998，16.

[2]肖培云等.HPLC同時測定小兒導赤片中大黃素、大黃酚的含量[J]. 中成藥，2008(30)，280.

[3]衛生部.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：231-232，22，附錄130-131.

國家社會科學基金西部項目“彝族醫藥文化遺產保護與傳承研究”(NO：12XMZ077)及2011-2012年度國家藥品標準提高項目(NO：WX-11-83)資助。

徐士奎(1980～)，男，主管藥師，藥學博士，研究方向：彝族傳統醫藥知識體系、質量標準、彝藥資源學。

R284

A

1007-2349(2015)08-0074-03

2015-06-11)