益腎養陰合劑對MRL/lpr小鼠免疫調節機制的研究

李東云，張巍瓊，顧玲麗，吳 洋

(1.云南省昆明市中醫醫院，云南 昆明 650011；2.云南省中醫醫院，云南 昆明 650011)

益腎養陰合劑對MRL/lpr小鼠免疫調節機制的研究

李東云1，張巍瓊1，顧玲麗1，吳 洋2△

(1.云南省昆明市中醫醫院，云南 昆明 650011；2.云南省中醫醫院，云南 昆明 650011)

目的 探討益腎養陰合劑對MRL/lpr小鼠中的CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-l0的影響。揭示益腎養陰合劑對MRL/lpr小鼠免疫紊亂發揮療效作用的調節。方法 將C57BL/6雄性小鼠分2組，第1組生理鹽水對照；第2組正常中藥組(益腎養陰合劑)。再將 MRL/1pr 雄性小鼠隨機分為4組：第3組為生理鹽水對照組；第4組為中藥組(益腎養陰合劑)；第5組為中西藥組(益腎養陰合劑+醋酸潑尼松片)；第6組為西藥組(醋酸潑尼松片)。各組小鼠均為10只。予每日灌胃連續治療4周。4周后處死，取各組小鼠(每組取5只)新鮮脾臟組織進行研磨、淋巴細胞分離后，用流式細胞術檢測CD4+、CD8+細胞比例；再取余下各組5只小鼠新鮮脾臟組織為兩部分，一部分用ELISA法檢測組織IL-10、IFN-γ濃度；另一部分運用RT-PCR實驗檢測IL-10、IFN-γmRNA含量。結果 1.4組MRL/1pr小鼠CD4+較C57BL/6小鼠低且治療后以中藥加激素組升高明顯(P<0.05)；4組MRL/1pr小鼠CD8+較C57BL/6小鼠高，在治療后，中藥加激素組較MRL/1pr小鼠生理鹽水組降低(P<0.05)；CD4+/CD8+的比值中4組MRL/1pr小鼠與C57BL/6治療前無差異且MRL/1pr比值最低，給予治療后以MRL/1pr中藥配合激素組升高最為明顯(P<0.05)。2.MRL/1pr小鼠IL-10較C57BL/6小鼠有不同程度升高，經治療后以中藥配合西藥組降低明顯(P<0.05)；MRL/1pr小鼠IFN-γ較C57BL/6小鼠有不同程度降低，經治療后以中藥配合西藥組升高明顯(P<0.05)；IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA的表達6組間比較差異性與蛋白變化(ELISA結果)一致。結論 益腎養陰合劑可通過對CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-10的調節緩解MRL/1pr小鼠病情，且治療調節了CD4+/CD8+比例，說明益腎養陰合劑對調節MRL/1pr小鼠免疫紊亂具有一定療效。

益腎養陰合劑；MRL/1pr小鼠；免疫調節

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是自身免疫介導的，以免疫性炎癥為突出表現的彌漫性結締組織病。流行病學研究顯示，我國患病率為70/10萬，婦女中則高達113/10萬人，其5年存活率為90%，10年存活率為80%[1]。通常以皮膚損害的紅斑為主稱為“陰陽毒”。闡明免疫細胞的機制研究對SLE的發病作用，探尋新的治療靶點及制定個性化治療方案有著重要的意義。

益腎養陰合劑是根據云南省中醫醫院風濕科常見的協定方藥，該方具有益氣固腎、養陰清熱之功效，其主要組方為黃芪生脈六味二至丸加減化裁而成(黃芪、黨參、麥冬、五味子、女貞子、旱蓮草、熟地、山藥、山茱萸、澤瀉、牡丹皮、茯苓、金櫻子、甘草)。該方在臨床上使用證實具有益氣固腎、養陰清熱，治療系統性紅斑狼瘡的相應免疫調節作用。本文就是探索該方是否對免疫紊亂具有調節作用的功效。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及動物 純種6～8 周MRL/1pr 雄性小鼠，40只,體重(28.0±3.0) g, C57BL/6背景小鼠6～8周,雄性20只(與MRL/1pr小鼠為同種系)，SPF級,2種小鼠均由南京大學-南京生物醫藥研究院提供(由美國Jackson實驗室引進)，許可證號：SCXK(蘇)2010-0001。益腎養陰合劑(黃芪30 g，黨參20 g，麥冬20 g，五味子10 g，女貞子15 g，墨旱蓮15 g，熟地15 g，山藥15 g，山茱萸10 g，澤瀉10 g，牡丹皮10 g，茯苓15 g，金櫻子10 g，甘草5 g)共200 g。中藥由云南省中醫醫院煎藥房統一煎煮，4℃冰箱保存。醋酸潑尼松片，由云南省中醫醫院藥房提供，(重慶科瑞制藥(集團)有限公司，批號：H50020459，規格：5mg/片)。

1.2 試劑與儀器 高速微量離心機、酶標儀(Molecular Devices)、核酸蛋白檢測儀、流式細胞儀(CyFlow Space)、IFN-γ ELISA試劑盒、IL-10 ELISA試劑盒(美國RayBiotech，Inc)、Rat anti mouse CD4 流式抗體、Rat anti mouse CD8 流式抗體(北京四正柏)等。

2 實驗方法

2.1 動物分組與給藥

2.1.1 藥物制備 中藥煎煮加800 mL水，煎煮20 min后，煎煮得到200 mL中藥湯劑。小鼠每次給藥為0.3 mL/20 g體重[2](相當于生藥量1.15 g/mL)。成人激素量為5 mg/d，則小鼠激素用量為0.013 mg/20 g ,則用激素量加蒸餾水制備0.3 mL/20 g懸液。

2.1.2 動物分組以及給藥方式 兩種同種系不同品種小鼠共分為6組，每組10只。將C57BL/6雄性小鼠分2組，第1組生理鹽水對照；第2組正常中藥組(益腎養陰合劑)。再將MRL/1pr雄性小鼠隨機分為4組：第3組為生理鹽水對照組；第4組為中藥組(益腎養陰合劑)；第5組為中西藥組(益腎養陰合劑+醋酸潑尼松片)；第6組為西藥組(醋酸潑尼松片)。各組小鼠均為10只。予以每日灌胃連續治療28 d。

2.2 標本制備 給藥4周后，在無菌RNase環境下，用腹腔麻醉小鼠(0.001ml/g體重)，分離取材各組5只小鼠脾臟組織，一部分放入無菌Rnase的EP管中，用作RT-PCR實驗，一部分放入無菌的EP管中，用作ELISA實驗。

2.3 流式細胞儀檢測CD4+、CD8+細胞比例 (1)將各組5只小鼠脫頸處死，在超凈臺中分離出小鼠脾臟，無菌操作；進行脾臟研磨，室溫離心，吸出淋巴細胞層再室溫離心收集細胞并計數；(2)取上述制備好的小鼠淋巴細胞，每只小鼠的脾臟細胞平均分為A、B、C、D 4管，A管為空白管，B管中加入10 μL CD4-FITC流式抗體，C管中加入10 μLCD8-PE流式抗體，D管中各加入CD4-FITC和CD8-PE流式抗體，均與管底細胞混勻，室溫避光孵育20 min；制成單細胞懸液，上流式細胞儀檢測CD4+，CD8+。

2.4 ELISA實驗步驟

2.4.1 樣本制備 取出備用脾臟組織，裂解后上超聲細胞破碎儀冰浴上勻漿至均勻無顆粒，取上清。

2.4.2 操作步驟 準備試劑，在酶標板上每孔對應加入樣品、標準品。4℃孵育過夜，加入檢測抗體，室溫孵育1h ，加入100μL 工作液，室溫孵育45min，加入100μL 底物試劑，室溫孵育30min，每孔加入50μL終止液，酶標儀上450nm波長處讀數。

2.5 RT-PCR實驗檢測IL-10、IFN-γ mRNA含量 查找mouse的IFN-γ和IL-10的mRNA序列，送交廣州合成。提取總RNA，合成cDNA第一條鏈，再用PCR法擴增目的基因，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，運用BIO-RAD凝膠成像系統進行凝膠成像，用Image J軟件測量灰度值，最后測目的基因和內參β-actin電泳條帶灰度值的比值進行統計學分析。

3 結果

3.1 流式檢測結果 見表1、圖1。

表1 各組小鼠脾臟淋巴細胞CD4+、CD8+細胞的流式檢測結果

圖1 各組小鼠脾臟淋巴細胞CD4+、CD8+細胞的流式檢測圖

3.2 ELISA檢測IL-10和IFN-γ結果 表2。

表2 各組小鼠脾臟組織中IL-10、IFN-γ ELISA檢測結果

3.3 RT-PCR檢測IL-10和IFN-γ mRNA結果 見表3、圖2。

表3 各組小鼠脾臟組織中IL-10、IFN-γ RT-PCR灰度值比值分析結果(目的基因條帶灰度值/β-actin條帶灰度值，

注：*表示與C57BL/6+生理鹽水組相比有統計學差異，P<0.05；○表示與C57BL/6+中藥組相比有統計學差異，P<0.05；●表示與MRL/1pr+生理鹽水組相比有統計學差異；△表示與MRL/1pr+中藥組相比有統計學差異，P<0.05；▽表示與MRL/1pr +中藥聯合激素組相比有統計學差異；▲表示與MRL/1pr+激素組相比有統計學差異，P<0.05。

圖2 各組小鼠脾臟組織中IL-10、IFN-γ mRNA基因表達情況

(泳道1代表C57BL/6+生理鹽水組；泳道2代表C57BL/6+中藥組；泳道3代表MRL/1pr+生理鹽水組；泳道4代表MRL/1pr+中藥組；泳道5代表MRL/1pr+中藥聯合激素組；泳道6代表MRL/1pr+激素組)

4 討論

本次研究選擇的細胞因子IFN-γ[3]及IL-10[4]，CD4+、CD8+在當今的SLE研究中出現對Th1/Th2的比值的影響較為廣泛。通過調節外周血Th1/Th2型細胞因子平衡及提高CD4+/CD8+的比值可增強免疫應答已經是一個趨勢，同時反向調節作用即通過CD4+/CD8+的比值反映Th1/Th2，輔助T細胞和調節性細胞的損傷的不平衡已經提出能夠參與自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡的發病機制。

本研究發現中IFN-γ水平的下降和IL-10水平的增高顯然是有聯系的，但根據筆者的實驗結果只能顯示兩者之間的負相關，而不能推斷它們的因果關系，IFN-γ下降或者是IL-10增高的先后順序及誰起先導作用則待進一步完善研究。同時發現，中藥配合激素對MRL/lpr小鼠CD4+/CD8+比值具有一定調節作用，也反映其Th1與Th2的比值可受反向調節分析存在可能，但Th1與Th2的分泌活動復雜，這也許只能為其中一項指標。了解Th1與Th2之間是否存在因果關系，對該病診斷、療效等開辟新方向。

[1]中華醫學會風濕病學分會.系統紅斑狼瘡診斷及治療指南[J].中華風濕病學雜志,2010,14(5):342-346.

[2]熊遠珍.實驗動物與人用藥量的新換算[J].江西醫學院學報,1997,12(30):41.

[3]McMurray RW,Hoffman RW, Nelson W,Walker SE.Cytokine mRNA expression in the B/W mouse model of systemic lupus erythematosuseanalyses of strain,gender,and age effects[J].Clin Immunol Immunopathol,1997,84:260-268.

[4]Chong W.P,Ip W.K,Wong W.H,et al. Association of interleukin-10 promoter polymorphisms with systemic lupus erythematosus[J].Genes Immun,2004,5(6):484-492.

Study on the Effect of Yishen Yangyin Mixture on the Immune Regulation Mechanism of MRL/lpr Mice

LI Dong-yun1, ZHANG Wei-qiong1, GU Ling-li1, WU Yang2

(1.TraditionalChineseMedicineHospitalofKunmingCity,Kunming650000,Yunnan; 2.YunnanTraditionalChineseMedicineHospital,Kunming650000,Yunnan)

Objective: To study the effect of Yishen Yangyin Mixture (YYM) on CD4+, CD8+, IFN-γ and IL-l0 of MRL/lpr mice and reveal its regulation effect on immune disorders of MRL/lpr mice. Methods: C57BL/6 male mice were divided into two groups, the 1st saline group and the 2nd normal YYM group, and MR /1pr male mice were randomly divided into 4 groups, the 3rd normal saline group, the 4th YYM group, the 5th YYM+ prednisone tablet group and the 6th prednisone tablet group, 10 mice per group. Each group was fed daily for 4 consecutive weeks. Four weeks later, the mice were killed to get fresh spleen tissue from 5 mice to be grinded and after separation of lymphocytes, flow cytometry was used to measure CD4+, CD8+cell ratio. Then another fresh spleen tissue were taken from the remaining five mice and divided into two parts. One part was used to assay IL-10 and IFN-γ concentration by ELISA and the other part to assay IL-10 and IFN-γmRNA content by RT-PCR. Results: A. After the treatment, CD4+of the 4th group increased significantly (P<0.05) when compared with that of the 6th group, and CD8+of the 4th group was higher than that of the 6th group and lower than that of the 1st group(P<0.05). The CD4+/CD8+ratio of the 4th group had no obvious difference before the treatment and the ratio of MRL / 1pr mice was lowest, but increased obviously(P<0.05)after the treatment. B. IL-10 of MRL/1pr mice increased to varying degrees when compared with that of C57BL/6 mice, and after the treatment, IL-10 of the 5th group was significantly lower (P<0.05). IFN-γ of MRL/1pr mice reduced to varying degrees when compared with that of C57BL/6 mice and after the treatment, IFN-γ of the 5th group increased significantly (P<0.05). In comparison of IL-10 mRNA presentation of these 6 groups, difference and protein changes (ELISA result) were consistent. Conclusion: Yishen Yangyin Mixture can regulate CD4+, CD8+, IFN-γ and IL-10 to remit the illness of MR /1pr mice, and adjust CD4+/CD8+ratio, thus indicating that Yishen Yangyin Mixture has a adjusting effect on the immune disorders of MRL /1pr mice.

Yishen Yangyin Mixture, MRL/1pr mouse, immunomodulatory

李東云(1987-)，女，湖北，研究方向：中醫痹證。

△通信作者：吳洋，Tel：13187705354，E-mail：451886900@qq.com

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1007-2349(2015)08-0071-04

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