電針合谷穴對實驗性牙髓痛大鼠三叉神經節P2X2、P2X3受體的影響

陳莉,張英,嚴琴,樂凱

(1.湖北中醫藥大學,武漢 430065;2.江漢大學,武漢 430056)

牙髓痛為口腔疾患中常見的癥狀之一,可見于西醫學的齲齒、牙髓炎、根尖周圍炎和牙本質過敏等。中醫學稱之為“骨槽風”“牙咬痛”“牙宣”。針刺合谷穴對牙髓痛具有良好的鎮痛作用[1-3],但其作用機理尚未明確。

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)不僅是細胞內最重要的能量分子,也是組織細胞間信息傳遞的信號分子[4]。疼痛、傷害性刺激使損傷細胞和應激細胞釋放大量ATP,引起P2X受體興奮激活,誘發動作電位沿著神經軸突向中樞神經系統傳遞,產生痛覺[5]。有研究[6-8]表明,ATP及其作用的受體特別是P2X2和P2X3受體參與了傷害性信息的傳遞。

電針合谷穴治療牙髓痛的作用與 P2X2、P2X3受體的關系目前還不明確。本實驗以大腸桿菌內毒素(LPS)誘導的牙髓痛大鼠為研究對象,采用RT-PCR檢測三叉神經節P2X2、P2X3受體mRNA的表達量,以探索電針合谷穴治療牙髓痛的可能機制,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

42只健康成年雄性SD大鼠,體重為180～250 g,均牙體、牙列完整,無齲壞、牙齒畸形及牙周病,咬合正常,由武漢大學動物實驗中心提供[許可證號SCXK(鄂)2008-0004]。

隨機分為正常組(N組)、對照組(C組)、牙髓痛組(M組)、拮抗劑組(A組)、電針組(E組)和拮抗劑+電針組(AE組),每組7只。

1.2 主要藥品與儀器

微量移液器(德國Eppendorf公司),Realtime PCR儀(美國ABI公司),冷凍離心機(美國Sigma公司),大腸桿菌內毒素(上海禾豐制藥,生產批號120801),A-317491(美國Sigma公司),Trizol(美國Invitrogen公司),氯仿、異丙醇、無水乙醇(滬試公司),PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(日本TAKARA公司),β-actin引物(上海生工公司),P2X3引物(上海生工公司)。

1.3 動物造模及治療方法

1.3.1 N組

不做任何處理。

1.3.2 C組

在鉆好的牙髓腔內注入與 M組等量的生理鹽水,浸潤5～6 min后用牙科填料將牙洞封閉。

1.3.3 M組

用小型電鉆或手鉆(鉆頭直徑約1 mm)在上頜一側第一和第二磨牙上鉆孔,深入牙髓腔并暴露牙髓,用微量注射器注入濃度為 5 μg/μL的LPS溶液(每孔注入約1～3 μL), 浸潤5～6 min后用牙科填料將牙洞封閉[9]。

1.3.4 A組

同 M組造模后,在注射器注入 LPS溶液時,將A-317491(0.5 mg/kg)同時注射進牙髓。

1.3.5 E組

取雙側合谷穴[10]。針刺后接電針治療儀,選連續波,頻率為2 Hz,強度為1 mA,留針30 min。每日1次,共治療3次。

1.3.6 AE組

同M組造模后,采用拮抗劑配合電針治療。拮抗劑治療同A租,電針治療同E組。

1.4 樣本采集

大鼠腹腔注射 10%的水合氯醛麻醉后斷頸處死,立即取出三叉神經節。

1.5 行為學分析

觀察每組大鼠開始治療第1天至最后1天的體重變化及外觀變化。觀察每組造模后30 min行為學變化,包括大鼠身體和頭部梳理、挖掘和探究、直立動作。

1.6 RT-PCR檢測三叉神經節P2X2、P2X3受體mRNA表達

1.6.1 逆轉錄反應

采用 Trizol RNA提取試劑盒提取三叉神經節總RNA。將 4 μL 5×RT Buffer、2 μL dNTP、1 μL Oliga(dT)18、1 μL RNase Inhibitor、1 μL ReverTra Ace和1 μg RNA加RNase free H2O調至20 μL。42℃ 20 min,將mRNA逆轉錄為cDNA;95℃ 5 min滅活逆轉錄酶后－20℃保存。

1.6.2 實時熒光定量檢測P2X2、P2X3的mRNA

采用 SYBR Green熒光染料法針對 P2X2、P2X3的 mRNA進行實時 RT-PCR檢測,吸取逆轉錄反應產物10 μL引物上下游各2 μL,加緩沖液10 μL、ddH2O 4 μL以及 SYBR Green熒光染料 1 μL,放入熒光定量PCR儀,50℃持續 2 min,接著 95℃持續 10 min,然后95℃持續15 s;退火1 min后,95℃持續15 s,然后60℃持續15 s,最后95℃持續15 s。如上進行45個循環,經4℃延伸10 min。設置陰性對照和β-actin內參照。對P2X2、P2X3受體CT值進行標準化,得到各組P2X2、P2X3受體mRNA相對表達量。

1.7 統計學方法

所有數據采用SPSS19.0統計軟件進行分析,實驗結果以均數±標準差表示,多組兩兩比較用單因素方差(One-Way ANOVA)分析,組間析因分析用LSD檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學及體重變化情況

正常大鼠皮毛光潤,行動自如,體重穩定增長。LPS造模后,大鼠皮毛萎縮無光澤,行動遲緩,并有跛足現象出現,體重增加不明顯。觀察注射后30 min大鼠的行為變化可以發現,造模大鼠身體和頭部梳理、挖掘和探究、直立動作次數明顯增多,各組大鼠行為學及體重變化情況見表1、2。

由表1、2可見,M組、A組、E組和AE組行為學變化均顯著高于C組和N組(P＜0.01);A組、E組和AE組行為學變化均顯著低于M組(P＜0.01)。

表1 各組大鼠行為學變化比較

由表2可見,C組體重顯著低于N組(P＜0.01);M組、A組、E組和AE組體重均顯著低于C組和N組(P＜0.01);E組、AE組體重均顯著高于 M組和 A組(P＜0.01,P＜0.05);A組體重稍高于M組(P＜0.05);AE組體重顯著高于E組(P＜0.01)。

表2 各組大鼠體重變化比較 (±s,g)

表2 各組大鼠體重變化比較 (±s,g)

注:與N組比較1)P＜0.01;與C組比較2)P＜0.01;與M組比較3)P＜0.01,4)P＜0.05;與A組比較5)P＜0.01,6)P＜0.05,與E組比較7)P＜0.01

組別 n 體重差值N組 7 15.43±2.55 C組 7 13.45±2.691)M組 7 4.61±3.6971)2)A組 7 6.50±2.321)2)4)E組 7 7.39±2.751)2)3)6)AE組 7 8.81±3.741)2)3)5)7)

2.2 各組大鼠三叉神經節P2X2、P2X3受體mRNA表達比較

由表3可見,M組、A組和E組P2X3受體mRNA表達量均高于C組(P＜0.05),且顯著高于N組(P＜0.01);A組、E組和AE組P2X3受體mRNA表達量顯著低于M組(P＜0.01);AE組P2X3受體mRNA表達量明顯低于E組(P＜0.01);A組 P2X3受體 mRNA表達量低于 E組(P＞0.05);AE組P2X3受體mRNA表達量稍高于C組及N組(P＞0.05)。

表3 各組大鼠三叉神經節P2X3受體mRNA相對表達量比較(±s)

表3 各組大鼠三叉神經節P2X3受體mRNA相對表達量比較(±s)

注:與N組比較1)P＜0.01;與C組比較2)P＜0.05;與M組比較3)P＜0.01;與E組比較4)P＜0.01

組別 n P2X3受體mRNA相對表達量N組 7 0.497014±0.079862 C組 7 0.509174±0.071955 M組 7 1.269092±0.0930731)2)A組 7 0.711712±0.0686031)2)3)E組 7 0.802410±0.0530001)2)3)AE組 7 0.603285±0.0660743)4)

表4 各組大鼠三叉神經節P2X2受體mRNA相對表達量比較(±s)

表4 各組大鼠三叉神經節P2X2受體mRNA相對表達量比較(±s)

注:與N組比較1)P＜0.01;與C組比較2)P＜0.01;與M組比較3)P＜0.05;與A組比較4)P＜0.05;與E組比較5)P＜0.05

組別 n P2X2受體mRNA相對表達量N組 7 0.091889±0.001779 C組 7 0.087914±0.006766 M組 7 0.150695±0.0034681)2)A組 7 0.126364±0.0066581)2)3)E組 7 0.136770±0.0038441)2)3)4)AE組 7 0.123643±0.0050381)2)3)5)

由表4可見,M組、A組、E組和AE組P2X2受體mRNA表達量均顯著高于N組和C組(P＜0.01);A組、E組和AE組P2X2受體mRNA表達量低于M組(P＜0.05);A組P2X2受體 mRNA表達量低于 E組(P＜0.05);E組 P2X2受體mRNA表達量高于AE組(P＜0.05)。

3 討論

ATP作為一種重要的神經遞質從感覺神經末梢釋放,與傷害感受器上一些表達疼痛的分子結合從而參與疼痛的信息傳遞[11]。研究表明,P2X受體活化是ATP參與疼痛的機制,作用于疼痛的發生和發展[12-13]。P2X作為配體門控非選擇性陽離子通道受體[14]有7種亞型(P2X1-7),其中 P2X3受體在疼痛信息的傳遞起重要作用[15-17]。當疼痛、傷害性剌激引發細胞以及感覺神經末梢的ATP大量釋放,引起P2X3受體激活和興奮,進而誘發動作電位沿著神經系統傳遞,產生疼痛。有研究[3-5]證實,ATP及其作用的受體特別是P2X2和P2X3受體參與了傷害性信息的傳遞。牙髓痛是由牙髓的神經末梢傳導至外周感受器三叉神經節的感受神經元,經收集后傳入下一級神經元,最后到中樞相應部位,由大腦皮層作出痛反應。P2X3受體在三叉神經節高表達,尤其是選擇性地表達在中、小細胞上[18]。P2X2、P2X3受體高選擇性地表達于中、小直徑三叉神經元中[19]。

LPS注射制備的炎性牙髓痛模型具有一定優勢[9]。大鼠注入LPS到牙髓腔后使外周傷害性感受器敏感性增強,繼而神經末梢的ATP大量釋放,引起P2X3受體激活和興奮,誘發動作電位沿著神經系統傳入三叉神經節和中樞神經系統,從而產生痛覺。A-317491是 P2X3受體特異性拮抗劑,它的應用也可推斷 ATP和P2X3受體與牙髓痛的傳遞有關。

本實驗結果顯示,M組大鼠三叉神經節P2X2、P2X3受體mRNA表達量均顯著高于C組(P＜0.01)。A組大鼠三叉神經節P2X2受體和P2X3受體mRNA表達量均低于M組(P＜0.05,P＜0.01),這和其他研究者的實驗結果[20]一致,說明A-317491作為P2X3受體的特異性拮抗劑,可抑制 P2X3受體的表達,可推斷 A-317491對 P2X2受體有一定的拮抗作用,證實P2X2、P2X3受體參與牙髓痛的痛覺的形成與傳遞。

合谷是手陽明大腸經的原穴,出自《靈樞·本輸》,善治頭面、五官疾患,是針灸臨床治療牙痛的效穴[21-22]。針刺合谷穴治療牙髓痛可能就是通過激活腦區而發揮作用[23],通過刺激中央后回中下部感覺區、中央前回下部運動區、第二感覺運動區、小腦及錐體外系等多個腦區,并且誘導顳葉腦組織血流量和血流容積的增加發揮鎮痛作用。針刺鎮痛與ATP、P2X受體之間的關系也開始被關注[24]。

本實驗結果表明,E組三叉神經節P2X2受體和P2X3受體mRNA表達量均低于M組(P＜0.05,P＜0.01),提示電針合谷穴可能通過抑制 P2X2、P2X3受體的表達起到有效的鎮痛作用。A組大鼠三叉神經節P2X2受體mRNA表達量低于E組(P＜0.05),提示A組在抑制P2X2受體的表達優于E組;而A組在抑制P2X3受體的表達雖低于 E組,但兩組比較差異無統計學意義(P＞0.05),推斷兩組在抑制P2X3受體表達的作用相仿。

從以上實驗結果可以推斷在拮抗劑與電針合谷對P2X2、P2X3受體起抑制作用的前提下,拮抗劑與電針合谷在抑制 P2X3受體作用大概一致,拮抗劑在抑制 P2X2受體優于電針合谷,這可能與局部使用A-317491可阻斷由ɑ,β-亞甲基三磷酸腺苷及P2X激動劑誘導的傳入神經活化和機械致敏反應有關,它作為一種外周作用嘌呤受體阻滯劑,能有效阻斷 P2X2、P2X3受體介導的ATP炎性機械痛覺過敏反應[25],因而拮抗劑對 P2X2有較好的抑制作用。

本實驗結果顯示,AE組大鼠三叉神經節P2X2受體和 P2X3受體 mRNA表達量均低于 M組(P＜0.05,P＜0.01),提示拮抗劑配合電針能有效抑制P2X2、P2X3受體。AE組大鼠三叉神經節P2X2受體和P2X3受體mRNA表達量均低于E組(P＜0.05, P＜0.01),推測拮抗劑配合電針抑制P2X2、P2X3受體優于單純電針治療。而AE組大鼠三叉神經節P2X3受體mRNA表達稍高于N組和C組(P＞0.05),推斷拮抗劑配合電針在抑制P2X3受體表達顯示出拮抗劑與電針的協同優勢。

綜上所述,P2X2、P2X3受體參與了實驗性牙髓痛的產生與傳導,電針對牙髓痛的鎮痛作用與 P2X2、P2X3受體參與密切相關,這可能是電針合谷穴鎮痛的機制之一,電針合谷穴如何調節 P2X3受體的信號轉導還有待進一步研究。

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