針刺太陽、風池穴對腦缺血再灌注家兔熱休克蛋白70及細胞凋亡的影響

趙軍,蘭惠羽

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院,哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學,哈爾濱 150040)

腦缺血再灌注損傷是在缺血性損傷的基礎上發展而來的,病理生理過程復雜,涉及到氧自由基增多、鈣超載、微血管損傷和細胞功能代謝障礙等多個環節[1-3]。因此,闡明腦缺血再灌注損傷的機制和尋找有效的治療靶點已成為目前亟待解決的重要課題。近年來實驗研究表明針刺對腦缺血再灌注損傷具有顯著的保護作用,日益受到關注[4-6]。

太陽穴和風池穴是臨床上針刺治療缺血性腦卒中主要的穴位,合稱為“頭四關穴”。本研究通過電針“頭四關穴”對缺血再灌注家兔腦組織中HSP70蛋白表達和細胞凋亡的影響,探討其對神經細胞保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

54只健康雄性新西蘭白兔,清潔級,4～5月齡,體重為2.5～3.0 kg,由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。隨機分為假手術組、模型組和針刺組,每組 18只。每組根據再灌注1、3、7 d 3個時間點,隨機各取6只。所有動物自由進食和水,12 h晝夜節律喂養。

1.2 主要試劑及儀器

HSP70免疫組化一抗,購自武漢博士德生物工程有限公司;細胞凋亡(Tunnel法)檢測試劑盒,購自美國Roche公司;PV二步法試劑和DAB顯色劑,購自北京中杉金橋生物公司。其他為國產分析純。

儀器為德國菜卡2135型組織切片機;美國motic公司 moticam 3000顯微攝影成像系統;Image-pro plus6.0病理圖像分析系統;上海安亭臺式離心機。

1.3 動物模型的制備

[7-9],采用線栓法建立家兔局灶腦缺血再灌注損傷模型。先將直徑為0.285 mm的3號尼龍線剪成10 cm長,在距一端0.5～1.0 cm處均勻涂上硅橡膠,控制線栓頭端直徑在0.51～0.55 mm,并在距離線栓頭端6.0 cm處做標記。

家兔術前禁食 12 h,稱重后自耳緣靜脈緩慢注射20 g/L的烏拉坦(5 mL/kg)麻醉,常規消毒后,頸部正中切口,暴露出左側頸總動脈(CCA)及分叉,并分離出近段頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)。暫時夾閉 CCA和ICA,結扎ECA并于近端將其剪斷,將線栓經ECA殘端向ICA內緩緩送入,松開ICA動脈夾。當線栓進入大腦中動脈(MCA)起始部遇阻力時停止,記錄造成大腦中動脈閉塞(MCAO)時間。記算線栓插入深度,并將 ECA殘端及線栓一同結扎固定。再灌注時,用鑷子夾住線栓外露殘端輕輕向外拉出,遇到明顯阻力感停止牽拉,記錄時間作為再灌注開始時間。結扎頸內動脈,徹底止血后縫合切口。

假手術組家免除不栓塞大腦中動脈外,其余處理同模型組和針刺組。參照文獻[10-11]中的評分法,0分為無神經缺損癥狀;1分為右前肢屈曲;2分為向右旋轉;3分為向右傾倒;4分為不能行走或昏迷。其中1～4分為有效模型,納入實驗分組。

1.4 干預方法

參考實驗針灸學[12],選取家兔“頭四關穴”,即雙側太陽穴和風池穴。用長40 mm毫針,太陽穴水平向后斜刺5 mm,風池穴向后下方斜刺5 mm。針刺后,雙側太陽及風池穴連接電針儀,頻率為 2 Hz,采用連續波,刺激強度以針柄震顫且家兔安靜不掙扎為度,治療時間為30 min。針刺組在造模成功后6 h開始首次針刺,各時間點療程分別為1 d、3 d和7 d。每日1次。假手術組和模型組家兔除不針刺外,每日同樣抓取。

1.5 指標檢測

各組家免于相應時間點烏拉坦( 5 mL/kg)麻醉后,心臟取血分離血清。然后用4%的多聚甲醛PBS液進行心臟灌注固定后取腦,自視交叉向前后各取厚 2.5 mm的冠狀腦片,常規石蠟包埋,連續切片備用。

HE染色觀察各組家兔腦組織缺血區病理變化;免疫組化PV二步法檢測缺血區周圍腦組織HSP70蛋白表達,Tunnel法檢測缺血區周圍腦組織中神經細胞凋亡情況,按說明書進行操作。免疫組化和細胞凋亡分析采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統,每張切片于梗死灶周圍選擇10個表達最強的高倍視野(400倍)計算陽性細胞數。

1.6 統計學方法

采用SPSS18.0軟件進行統計處理,實驗數據以均數±標準差表示,多組數據比較使用單因素方差分析,兩兩比較用t檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 病理形態學觀察

假手術組腦組織均未見明顯病理改變。模型組家兔左側大腦皮質及基底核區可見明顯的梗死灶,缺血中心區神經纖維呈網格狀改變,神經元數量明顯減少;缺血區周圍腦組織水腫,炎細胞增多;神經元變性壞死,細胞核固縮或溶解,胞漿呈嗜酸性變;膠質細胞明顯增多;上述病理改變以3 d時最為明顯。針刺組各時間點與模型組各時間點相比,梗死灶均有不同程度減小,梗死灶內神經元數量明顯增多,腦水腫和炎細胞浸潤明顯減輕;缺血周圍神經元形態均有不同程度的改善。

2.2 腦組織HSP70表達

HSP70蛋白主要表達在神經元胞質中,陽性細胞呈現淡黃色、黃色或棕黃色。假手術組HSP70陽性細胞數目較少,顏色較淡。模型組各時間點HSP70蛋白表達陽性細胞數目明顯增多,且顏色較深,與假手術組比較,差異均具有統計學意義(P＜0.01)。針刺組各時間點 HSP70蛋白表達陽性細胞數目明顯增多,且顏色較深,與假手術組和模型組比較,差異均具有統計學意義(P＜0.01)。 詳 見 表 1、 圖 1-3。

表1 各組腦組織HSP70蛋白表達陽性細胞數目比較(±s,個)

表1 各組腦組織HSP70蛋白表達陽性細胞數目比較(±s,個)

注:與假手術組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別 n 再灌注1 d 再灌注3 d 再灌注7 d假手術組 6 11.05±1.87 9.51±2.43 11.01±2.37模型組 6 23.83±1.721) 18.51±1.871) 15.17±1.161)針刺組 6 32.00±3.031)2) 26.84±1.171)2) 21.33±1.631)2)

圖1 假手術組HSP70組化示意圖

2.3 腦組織細胞凋亡

圖2 模型組HSP70組化示意圖

圖3 針刺組HSP70組化示意圖

TUNEL主要標記在神經元及膠質細胞細胞核中,呈黃色或棕黃色。假手術組凋亡細胞數目較少。模型組各時間點凋亡細胞數目隨再灌注時間的延長而逐漸增多,至3 d達高峰,與假手術組比較,差異均有統計學意義(P＜0.01)。針刺組各時間點凋亡細胞數明顯減少,優于假手術組和模型組(均P＜0.01)。見表2、圖4-6。

表2 各組TUNEL表達陽性細胞數比較 (±s,個)

表2 各組TUNEL表達陽性細胞數比較 (±s,個)

注:與假手術組比較1)P＜0.01;與模型組比較2)P＜0.01

組別 n 再灌注1 d 再灌注3 d 再灌注7 d假手術組 6 6.00±1.41 5.33±1.21 6.67±1.21模型組 6 17.66±1.631) 29.17±2.791) 25.16±1.471)針刺組 6 12.84±1.941)2) 18.00±1.421)2) 13.00±1.521)2)

圖4 假手術組TUNEL示意圖

圖5 模型組TUNEL示意圖

圖6 針刺組TUNEL示意圖

3 討論

HSP70是熱休克蛋白家族中含量最高和最保守的一類蛋白,在細胞的信息傳遞、生長和分化中起到重要的調控作用,同時對細胞的損傷能產生自我保護作用,被認為是評價缺血性腦損傷程度的重要指標。在機體缺血缺氧、創傷和氧化應激等過程中,中樞神經系統內HSP70含量明顯增加,在腦缺血早期對神經元起到保護的作用,而缺血后期對神經細胞損傷的修復有著重要作用[13]。

臨床研究表明,針刺風池可以改善大腦的缺血缺氧狀況,增加腦血流量,改善腦部血液循環功能,可以誘導腦細胞的缺血耐受機制,降低外周血管阻力,改善微循環和側支循環,減輕腦組織損傷,對腦缺血性疾病具有較好的治療作用[14]。針刺“頭四關穴”可顯著改善偏頭痛患者的腦血流速度與狀態,降低偏頭痛患者的血漿ET、NO水平,調節患者血漿內5-HT含量。另有研究[15]表明,針刺“頭四關穴”對缺血性腦卒中患者有較好的治療作用,其作用機制可能是通過調節血漿中ET-1的含量。

本實驗免疫組化結果顯示,模型組 HSP70蛋白陽性表達細胞數目明顯增多,針刺“頭四關穴”后各時間點HSP70蛋白陽細胞數較模型組均明顯增加。病理和細胞凋亡結果表明,模型組家兔左側腦組織呈網格狀改變,梗死灶明顯,神經細胞凋亡數量明顯增加,腦神經細胞損傷程度較重。針刺組各時間點的梗死灶均有不同程度減小,神經元數量明顯增多,神經細胞凋亡數量明顯減少,腦組織缺血性損傷有一定程度改善。

我們推測腦缺血再灌注后,損傷的腦組織中產生大量的氧自由基和興奮性氨基酸等對神經細胞有毒性作用的物質,并且通過級聯反應誘導細胞凋亡的發生,加重了神經細胞損傷程度[16]。針刺“頭四關穴”能夠改善缺血再灌注損傷后腦組織血流量和血流狀態,通過提高缺血后腦組織中 HSP70蛋白表達,調控氧自由基和興奮性氨基酸等產生的毒性級聯反應,從而抑制了神經細胞凋亡起到神經保護作用。

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