實驗性APS小鼠經口服β2糖蛋白后Th17細胞及RORγt mRNA表達變化

谷文靜，熊 斌，譚 巖，方艷秋＊，付 嘉

（1.天津醫科大學免疫學教研室，天津300071；2.濟寧醫學院外科總論教研室，山東濟寧272067；3.吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，吉林長春130021；4.濟寧醫學院基礎學院免疫教研室，山東濟寧272067）

實驗性APS小鼠經口服β2糖蛋白后Th17細胞及RORγt mRNA表達變化

谷文靜1，熊 斌2，譚 巖3，方艷秋3＊，付 嘉4

（1.天津醫科大學免疫學教研室，天津300071；2.濟寧醫學院外科總論教研室，山東濟寧272067；3.吉林省人民醫院醫學診治實驗中心，吉林長春130021；4.濟寧醫學院基礎學院免疫教研室，山東濟寧272067）

抗磷脂抗體綜合征（Antiphospholipid antibody syndrome，APS）是一種系統性的自身免疫性疾病，該病以反復發作的血栓和流產為主要特征和臨床表現，患者血清中可檢出持續存在抗磷脂抗體（APA）［1］。APS的確切病因目前還不很清楚，除遺傳因素和微生物感染參與疾病發生外，大量證據顯示，自身反應性T淋巴細胞參與APS的發病，并輔助自身反應性B細胞活化產生抗磷脂抗體（APA），致炎因子TF、TNF－α、IL－6、ET－1等大量生成，內皮細胞和血小板活化，凝血因子和補體激活等，導致APS血栓形成、血管炎癥。鑒于致炎因子IL－6在誘導CD4＋細胞向Th17分化中發揮重要作用；激活的補體可通過TLR4信號途徑促進Th17的發育；同時來自SLE的Th17分泌的IL－17A可誘導人臍靜脈內皮細胞表達ICAM－1等黏附分子，促進SLE血管炎癥［2－6］。故而我們推測Th17在APS的發病機制中發揮重要作用。

我們前期工作顯示CD4＋CD25＋Treg參與實驗性APS（EAPS）的口服耐受機制。本研究采用RT－PCR檢測EAPS小鼠PBMC中轉錄因子RORγt mRNA的表達變化，流式細胞術檢測EAPS小鼠PBMC中Th17細胞的百分率；以期進一步了解Th17在EAPS發病機制和口服耐受中所發揮的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 抗小鼠FITC anti－CD4、PE－－anti－IL－17購自美國BD公司及同型對照γ1／γ2購于美國BD公司；離子霉素（Ionomycin）、乙酸肉豆蔻佛波醇（phorbo lm yristic acetate，PMA）及布雷菲德菌素（brefeldin A，BFA）購自Sigma公司。CO2培養箱（GBB16Heraus，German）。流式細胞儀（FACSCalibur，BD公司，美國）；低溫高速離心機（Beckman，USA）；RPMI 1640培養液和Hank s＇液購自美國Gibco公司。PCR引物由上海生工生物公司合成。dNTP、Taq DNA聚合酶、TRIZOL、MML－V逆轉錄酶等購于晶美生物公司。

1.2 實驗動物 8－10周齡雌性BALB／c小鼠，購于吉林大學實驗動物中心，無特定病原菌條件下飼養。

1.3 人β2糖蛋白1的重組表達 見文獻［7］。

1.4 分組 將小鼠分為3組：正常對照組、EAPS模型組及口服耐受組。口服耐受組及EAPS模型組小鼠在模型建立前10天，分別以0.5mg rhβ2GP1／PBS灌胃，隔天灌胃1次共5次。

1.5 免疫方案——EAPS模型的建立及各項指標檢測 見文獻［8］。

1.6 流式細胞儀檢測小鼠PBMC CD4＋IL－17＋Th17細胞 用RPMI1640培養基調整外周血單個核細胞濃度為1×109／L，用24孔板進行培養，每孔加入200μl的細胞懸液，含PMA（25μg／L）、Ionomycin（1mg／L）和BFA（10mg／L），5%CO2，37℃孵育培養5h，間隔30分鐘搖勻一次。取出移至試管中，加10μl FITC anti－CD4，室溫避光孵育30 min。加100μl固定液孵育15min，PBS洗滌后加100μl破膜液，同時加入PE－－anti－IL－17及同型對照，孵育30min。以含1%多聚甲醛的PBS避光固定，待上機檢測。在FSC－SSC散點圖上圈定淋巴細胞群，用CD4和SSC射門。選擇CD4＋細胞分析IL－17的表達，收集細胞數10 000／管進行分析。流式細胞儀檢測，使用Cell Quest分析軟件進行分析。

1.7 RT－PCR檢測小鼠PBMC中RORγt mRNA表達 Trizol試劑提取總mRNA，在42℃進行逆轉錄。PCR體系中加入2.5UTaqDNA多聚酶，2.5 mM dNTPs，0.25μM引物，引物分別為RORγt（5’－CTGAGGGGCTGTCAAAGTG－3’）和（5’－AAG GCT GGG TGA AGG G－3’），或GAPDH（5’－TCCA CCACC CTG TT GCTGTA－3’）和（5’－ACCACAGTCC ATGCC ATCAC－3’）。94℃40s，56℃60s，72℃60s。94℃90s，72℃7min。共30個循環。擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像分析。檢測產物灰度值與內參的灰度值的比值表示RORγt mRNA的相對表達水平。1.8 統計學方法 數據以“均數±標準差”表示，應用SPSS10.0統計軟件進行方差分析，組間比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 小鼠PBMC中CD4＋IL－17＋Th17細胞百分率變化 在三組小鼠免疫后第4、8、12、16、20周檢測三組小鼠的Th17細胞在CD4＋T細胞百分率，結果發現，模型組在第4周開始逐漸升高，在第8、12、16周與正常對照組均具有顯著差異性（P＜0.05）。耐受組在各時間段與對照組相比，差異未見顯著性（P＞0.05）（圖1）。

2.2 小鼠PBMC中轉錄因子RORγt表達的變化三組小鼠免疫后4、8、12、16、20周RORγt mRNA表達變化（如圖2），自第4周，模型組小鼠表達水平逐漸升高，第8、12、16、20周差異顯著（P＜0.05）；耐受組小鼠PBMC中RORγt基因表達在各時間段明顯低于模型組（P＜0.05），與正常對照組無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 流式細胞術檢測口服耐受組、模型組及對照組小鼠PBMC中CD4＋IL－17＋T細胞百分率變化

圖2 RT－PCR檢測口服耐受組、模型組及對照組小鼠PBMC中RORγt mRNA表達變化

3 討論

長期以來，很多學者們認為Th1細胞介導了多種自身免疫性疾病的發生。然而，Langrish等研究發現：在基因敲除動物模型中，缺失能產生IL－17的（IL－17＋）T細胞可以使實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的發病受到抑制。Park等研究也發現：清除或中和EAE動物模型的Th1型細胞因子（IFN－γ或IL－12），并不能預防或減輕自身免疫性疾病的發生和進展。從而使人們認識到在此情況下，是IL－17＋T細胞誘導了自身免疫病的發生和進展。因此將這種能分泌IL－17的T淋巴細胞命名為一個新的亞群——Th17細胞。此后，隨著研究的不斷深入，越來越多的證據表明Th17細胞與自身免疫性疾病之間存在著密切的關系［9－12］。現已知道，IL－17表面表達IL－6R、IL－21R、CCR6、IL－23R、IL－1R等炎癥相關受體，核內表達維甲酸相關的孤兒核受體（RORγt）和STAT3。其中，RORγt是調控Th17細胞分化的關鍵轉錄因子，并可誘導IL－17的分泌，也是Th17的特異性標志［13－15］。

研究表明，口服自身抗原可誘導多種實驗性自身免疫病的耐受，這可以為特異性治療自身免疫性疾病提供新的途徑和思路。口服耐受的機制涉及免疫無能和缺失、主動抑制、旁路抑制等。通常高劑量抗原可誘導自身反應T細胞的克隆刪除和克隆無能，低劑量可誘導主動抑制。我們的前期工作表明，CD4＋CD25＋Treg參與EAPS的發病和口服耐受機制［8］。

Th17與Treg細胞都來源于初始CD4＋T細胞，兩者的功能和分化過程密切相關，在正常情況下兩者保持平衡［16］。當機體發生炎癥反應、自身免疫性疾病時，初始T細胞的分化格局發生變化，Th17細胞分化增強，導致一系列炎癥反應損傷機體。研究發現在多發性硬化癥（MS）、類風濕性關節炎（RA）、重癥肌無力（MG）、系統性紅斑狼瘡（SLE）等自身免疫病患者及動物模型中均存在Th17數量和功能的改變［9－11，17］。故而我們推測Th17細胞在APS發病機制和口服耐受中發揮作用。

本研究表明，自免疫第4周，自身反應性T、B淋巴細胞增殖活化，模型組小鼠PBMC中CD4＋IL－17＋Th17細胞開始升高，隨著疾病進展，CD4＋IL－17＋Th17細胞頻率繼續升高（P＜0.05），提示自身免疫反應產生的大量致炎因子如TNF－α［3］、IL－6［6］等可能促進了Th17細胞的分化。而耐受組在各時間段與對照組相比未見顯著差異（P＞0.05），顯示口服耐受可能對Th17細胞的發生、分化或分布產生影響。隨著CD4＋IL－17＋Th17細胞頻率升高，模型組小鼠PBMC中轉錄因子RORγt mRNA表達水平也相應升高（P＜0.05），耐受組小鼠PBMC中RORγt基因表達在各時間段均明顯低于模型組（P＜0.05），與正常對照組相比差異無顯著性（P＞0.05）。鑒于RORγt是調控Th17分化的關鍵轉錄因子，我們的研究結果提示APS進展與Th17的過度分化有密切關系；口服耐受可通過調節Th17的分化發揮作用。

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谷文靜（1982－），女，在讀碩士，主要從事免疫學、分子生物學方面的研究。

2014－08－16）

1007－4287（2015）10－1639－03

山東省自然科學基金項目資助課題（ZR2010CL017、ZR2014HL023）；濟寧市科技局項目資助課題；濟寧醫學院重點科研項目資助課題

＊通訊作者