miR－222在急性心肌梗死診斷的意義

羅 婠，熊 輝，韓 露，馬 培，周 新

（武漢大學中南醫院基因診斷中心，湖北武漢430071）

miR－222在急性心肌梗死診斷的意義

羅 婠，熊 輝，韓 露，馬 培，周 新＊

（武漢大學中南醫院基因診斷中心，湖北武漢430071）

目的研究血漿miR－222在急性心肌梗死患者中的表達水平變化。方法 收集患者發生急性心肌梗死后24小時內的全血，分離血漿提取總RNA，莖環法特異性逆轉錄為cDNA，以RNU6為內參基因，采用real－time qPCR方法檢測49例急性心肌梗死患者和31例健康對照者血漿中miR－222的表達水平。結果 miR－222在心梗組中的表達量為0.766（0.184，2.463），對照組表達量為0.149（0.027，0.213），采用非參數Mann Whitney U檢驗統計顯示，急性心肌梗死組miR－222表達水平明顯高于對照組（U＝291，P＜0.01）。ROC曲線下面積（AUC）為0.808（95%CI 0.714－0.913），miR－222診斷AMI的靈敏度和特異度分別為65.0%和93.5%。結論 急性心肌梗死患者血漿miR－222在心梗發生后24小時內表達量顯著升高，miR－222可能對于急性心肌梗死的診斷具有一定價值。

急性心肌梗死；血漿；微小RNA；實時熒光定量PCR

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1664）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是臨床最常見的最嚴重的急性心肌缺血性疾病，發達國家的發病率高于我國，但隨著社會的發展，人口老齡化、生活方式及飲食習慣的變化使得我國的AMI發病率呈逐年上升的趨勢［1－3］。血漿中肌紅蛋白、肌鈣蛋白（cTn）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK－MB）檢測為診斷AMI的金標準。近年來，隨著國內外對于miRNA研究得深入，其在各種疾病的發生發展過程中逐漸被人們所知。在心血管系統，miRNA已被證明在內皮功能障礙、細胞凋亡、血管生成等病理生理條件下有重要的作用［4，5］，臺灣有學者［6］研究發現與心肌損傷等病理過程相關的miRNA也能作為診斷急性心肌梗死的生物標志物，本研究通過觀察急性心肌梗死患者血漿miR－222水平的變化，探討其在AMI診斷中的意義。

1 對象與方法

1.1 對象 2014年3－8月在武漢大學中南醫院心血管內科收治的急性心肌梗死49例，男患者32例，女患者17例，年齡（64±12）歲，診斷符合中華醫學會心血管分會《急性心肌梗死診斷和治療指南》標準。對照組31例，來自武漢大學中南醫院同期體檢健康者，男20例，女11例，年齡（64±7）歲。

1.2 實驗方法

1.2.1 血漿總RNA的提取 病例組患者在典型胸痛24h內并在治療前，正常對照者在空腹8h后，采集外周靜脈血，EDTA－Na2抗凝。1小時內（室溫或4℃放置）12 000g，離心8min，分離血漿后采用QIAGEN公司miRNeasy Serum／Plasma Kit試劑盒提取總RNA，Nano drop 2000c分光光度儀檢測RNA濃度及純度。逆轉錄反應采用TAKARA公司PrimeScript RT reagent KIT試劑盒，莖環法特異性逆轉錄為cDNA，miR－222和RNU6的逆轉錄引物序列分別為：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCCAGTA和CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。反應體系：2μl 5xPrimeScript Buffer，0.5μl PrimeScript RT Enzyme Mix，0.5μl特異性引物（20μM），2μl Total RNA，5μl RNase－Free Water。程序設置為：42℃15min，85℃5s。反應完成后cDNA－20℃冰箱保存。

1.2.2 miRNAs的克隆驗證測序 擴增普通PCR并經電泳鑒定目的片段。用AXYGEN公司PCR Cleanup Kit試劑盒純化回收普通PCR產物，TAKARA公司pMD－19T載體連接純化產物，轉化克隆后交由上海睿迪公司測序驗證擴增片段是否正確。PCR擴增引物序列見表1。

表1 miR－222及RNU6擴增引物序列

1.2.3 Real－time qPCR檢測 將miR－222和RNU6質粒倍比稀釋成6個不同濃度，進行熒光定量PCR檢測，制作標準曲線，以觀察引物擴增效率。PCR試劑SYBR Premix Ex Taq II TM購于TAKARA公司。反應體系：10μl 2xSYBR Premix Ex TaqTM II；1μl特異性上游引物；2μl Universal Primer；6μl RNase－Free Water。程序依次如下：95℃30秒；3步循環—95℃5秒，55℃30秒，72℃30秒，45個循環。每個標本設3個復孔。

1.3 統計學分析 Real－time qPCR結果采用相對定量（2－ΔCt）方法進行分析。計算每個樣本三個復孔的Ct值均值作為實際樣本Ct值，減去同一樣本內參的Ct值均值，得到ΔCt值，再求得2－ΔCt值。運用SPSS 13.0統計學軟件，正態資料用均值±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗；非正態資料用中位數（四分位數區間）表示，采用非參數Mann Whitney U檢驗進行統計分析。受試者工作曲線（ROC曲線）判斷血漿miR－222診斷的靈敏度和特異度。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 克隆測序驗證結果 普通PCR擴增目的片段，轉化克隆后進行測序驗證，測序結果經BLAST比對顯示擴增片段miR－222及RNU6序列均正確。2.2 引物擴增效率驗證 可接受的有效的熒光定量PCR標準曲線斜率（sloop）應在－3～－3.5之間，相關系數（R2）應大于0.98，PCR擴增效率（E）在90%－110%之間。所有目標片段的擴增均符合以上要求。說明運用熒光定量PCR反應檢測目的RNA表達水平是穩定可靠的。

2.3 熒光定量PCR擴增曲線 本實驗采用熒光定量PCR方法測定miRNA表達水平，Ct值小于35認為是有效擴增，本研究Ct值均在27－35之間，結果合理可信。

2.4 miR－222表達水平 分析49例AMI患者與31例對照者血漿miR－222相對表達量，心梗組為0.7658（0.1838，2.4628），對照組表達量為0.1492（0.0265，0.2132），急性心肌梗死組血漿miR－222表達量顯著升高（U＝291，P＜0.01），且心梗組miR－222含量比對照組高出4倍左右。見表2。

表2 心梗組與對照組miR－222相對表達量比較

2.5 ROC曲線 以miR－222相對表達量繪制ROC曲線，曲線下面積（AUC）為0.808，miR－222對于AMI的診斷靈敏度和特異度分別為65%和93.5%。miR－222診斷AMI有較高價值。見圖1。

圖1 MiR－222診斷AMI的ROC曲線

3 討論

自1993年第一次發現miRNAs以來，估計基因組中大概存在2000多種miRNAs，調控60%以上的蛋白編碼基因［7］。miRNAs的異常升高或降低可引起多種疾病［8］。

很多研究已經觀察到miRNA在急性心肌梗死的患者血清／血漿中可發生變化，Wang等［9］發現在AMI患者血漿miR－1、miR－133a、miR－499和miR－208a的表達水平均明顯高于正常人和非AMI患者。今年國內有研究者發現血漿miR133、miR－1291和miR－663b在AMI患者中明顯高于非AMI患者［10］，且ROC Curve分析顯示，miR133、miR－1291和miR－663b均具有較高的診斷特異性和敏感性；該研究并發現ST段抬高心肌梗死（STEMI）患者術后這三種miRNA水平均有不同程度的下調。He［11］等在359例AMI患者中血漿樣本中檢測了miR－328和miR－124的表達水平，并進行了生存分析，結果表明miR－328和miR－124的表達水平顯著升高，且由于miRNA表達水平升高導致患者發生心衰或死亡的風險增加。

此前已有報道證實miR－222參與多種炎癥反應，并在多種疾病的發生、發展過程中扮演著重要的角色。其中有學者在研究中發現糖尿病和高脂血癥誘發的炎性反應可以通過選擇性下調miR－222的水平，以此上調間隙連接蛋白Cx43和Rho激酶的表達，從而刺激血管收縮［12］。通過對miR－222靶基因的預測，發現miR－222調控包括細胞周期蛋白在內的多種基因，推測miR－222有可能通過影響心肌細胞活動和血管反應參與到心血管疾病中。本研究發現血漿miR－222表達水平在AMI患者發作24小時內明顯升高（U＝291，P＜0.01），ROC曲線下面積為0.808，說明miR－222對于AMI的診斷具有較高的價值；靈敏度和特異度分別為65%和93.5%，具有較高特異度。

在臨床上將miRNA的表達和現有的心梗標志物肌紅蛋白、肌鈣蛋白（cTn）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK－MB）等聯合，可能為急性心肌梗死的診斷提供一條新的途徑。多種miRNAs表達譜的變化可能會更加靈敏診斷甚至早期預判心梗的發生。

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Association of Plasma miR－222 Expression Level with Acute Myocardial Infarction

LUO Wan，XIONG Hui，HAN Lu，et al.
（Center for Gene Dignosis，Zhongnan Hospital of Wuhan University，Wuhan 430071，China）

ObjectiveTo evaluate the plasma miR－222expression level as a diagnostic biomarker for acute myocardial infarction（AMI）.Methods The patients’blood was collected after AMI occurred in 24hours，Total RNA was extracted from separated plasma，stem－loop method was used to reverse transcript cDNA.RNU6as reference gene.The relative expression levels of plasma miR－222in 49AMI patients and 31health control were measured by real－time qPCR.Results The expression level of miR－222was significantly increased in AMI［0.766（0.184，2.463）］than health group［0.149（0.027，0.213）］（U＝291，P＜0.01）.The sensitivity and specificity of miR－222for diagnosing AMI were 65.0%and 93.5%respectively.The AUC（area under the curve）of ROC curve was 0.808（95%confidence interval 0.714－0.913）.Conclusion Plasma miR－222was up－regulated in AMI group，which may serve as a potential diagnostic biomarker for AMI.

acute myocardial infarction；plasma；miRNA；real－time qPCR

R542.2＋2

A

羅婠（1990－），女，碩士研究生，研究方向：重大疾病的分子診斷；周新，教授，博士生導師。

2014－12－30）

1007－4287（2015）10－1664－03

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）（2012CB720600）

＊通訊作者